S-a raportat că tatăl ei, Filip al II-lea, a fost bucuros la nașterea ei și s-a declarat a fi mai fericit decât ar fi fost la nașterea unui fiu. Filip avea deja un moștenitor de sex masculin, Don Carlos al Spaniei, copilul său din prima căsătorie cu Infanta Maria a Portugaliei; totuși, tatăl și fiul nu au dezvoltat o relație strânsă și frecvent au trăit în conflict unul cu celălalt.
Inițial, mama Isabellei, Elisabeta de Valois, a fost logodită cu Don Carlos, însă complicații politice neașteptate au necesitat căsătoria cu Filip. În ciuda diferenței semnificative de vârstă dintre părinții ei, atât Filip cât și Elisabeta au fost foarte atașați unul de celălalt; Filip a stat lângă soția lui chiar și atunci când ea a fost bolnavă de variolă. Isabella Clara Eugenia a avut o soră mai mică cu un an, Catalina Micaela. Mama lor a murit când Isabella Clara avea doi ani, în urma unei complicații de sarcină cu fiul ei nenăscut.
Isabella a crescut împreună cu Infanta Catalina Micaela, iubite de tatăl lor și de mama vitregă, Ana de Austria, cea de-a patra soție a regelui. Filip al II-lea a avut cinci copii cu Ana; toți au murit în copilărie cu excepția moștenitorului Filip al III-lea al Spaniei.
Isabella a fost singura persoană căreia Filip i-a permis să-l ajute în muncă, sortând hârtiile și traducând pentru el documente din italiană în spaniolă. Isabella a rămas apropiată de tatăl ei până la decesul acestuia, la 13 septembrie 1598.
Încă din 1568, de la vârsta de doi ani, a fost promisă lui Rudolf al II-lea, Împărat Roman (18 iulie 1552 – 20 ianuarie 1612), fiul împăratului Maximilian al II-lea și a Mariei a Spaniei. Împărăteasa Maria era mătușa Isabellei, fiind fiica lui Carol Quintul. Isabella a așteptat mai mult de 20 de ani înainte ca excentricul Rudolf să declare că el nu are nici o intenție să se căsătorească cu cineva.
După ce unchiul ei, Henric al III-lea al Franței, a fost asasinat de către tânărul călugăr fanatic Jacques Clément, la 2 august 1589, Filip al II-lea a pretins coroana franceză în numele Isabellei. Totuși Isabella nu avea drept la succesiune deoarece în Franța Legea Salică interzicea femeilor ascensiunea la tron iar mama Isabellei oricum semnase un document prin care ceda drepturile sale asupra coroanei franceze odată cu căsătoria cu Filip al II-lea al Spaniei. Cu toate acestea, Parlamentul din Paris a dat verdictul că Isabella Clara Eugenia este "suveranul legitim" al Franței. Liderul hughenoților, Henric de Navara, regele de drept prin legile tradiționale franceze, în cele din urmă s-a convertit la catolicism și a fost încoronat în 1594.
Tatăl Isabellei a decis să-i cedeze Țările de Jos Spaniole cu condiția să se mărite cu verișorul ei,
Arhiducele Albert de Austria. Ei au domnit peste Țările de Jos în comun ca duce/conte și ducesă/contesă. Urmau să fie succedați de către urmașii lor, cu preferință pentru urmașii pe linie masculină iar pentru urmașa pe linie feminină acesta trebuia să se căsătorească cu regele Spaniei sau cu o persoană aleasă de regele Spaniei. De asemenea, era prevăzut ca în cazul în care cuplul nu va avea copii, Țările de Jos să revină regelui Spaniei la moartea unuia dintre soți.
La 18 aprilie1599, la vârsta de 33 de ani, ea s-a căsătorit cu Albert, fratele mai mic al fostului logodnic Rudolf al II-lea. Isabella a născut trei copii: Arhiducele Filip (n. 21 octombrie 1605), Arhiducele Albert (n. 27 ianuarie 1607) și Arhiducesa Anna Mauritia; totuși toți trei au murit în copilărie.
Generațiile indică descendența de la Carol Quintul, sub care coroanele Castiliei și Aragonului s-au unit formând regatul Spaniei. Anterior, titlul de Infantă era folosit în diferite regate.
Elisabeta Marie, Prințesă de Windisch-Graetz •Helena, Ducesă Philipp de Württemberg** •Rosa, Ducesă de Württemberg** • Arhiducesa Dolores** • Maria Inmaculada, Nobile Inigo Neri Sereneri** • Margarita, Marchiză Taliani di Marchio** • Prințesă Maria Antonia, Mrs. Luis Pérez** • Arhiducesa Assunta, Mrs. Joseph Hopfinger** • Elisabeta, Contesă de Waldburg-Zeil** • Hedwig, Contesă de Stolberg-Stolberg** • Gertrud, Contesă de Waldburg-Zeil-Trauchburg** • Arhiducesa Maria Elisabeta** • Arhiducesa Agnes** • Arhiducesa Margarethe, Mrs. Alexander Cech •Ilona, Ducesă de Mecklenburg • Arhiducesa Anna Theresia • Arhiducesa Maria Kynga, Mrs. Joachim Krist
Generație 17
Arhiducesa Adelheid •Charlotte, Ducesă de Mecklenburg •Elisabeta, Prințesă Heinrich de Liechtenstein • Elisabeta, Edle Hubert von Braun** • Alice, BaronesăVittorio Manno** • Marie Antoinette, Baronesăde Prdef in Irnich** • Arhiducesa Marie Christine** • Arhiducesa Walburga, Mrs. Carlos Tasso** • Arhiducesa Verena** • Arhiducesa Katharina, Mrs. Roland Huber** • Agnes, BaronesăPeter de Fürstenberg** • Maria Ileana, Contesă Adam Kottulinski** • Alexandra, BaronesăViktor de Baillou** • Maria Magdalena, Baronesăde Holzhausen** • Arhiducesa Elisabeta, Mrs. Friedrich Sandhdeer** •Agnes, Prințesă Karl Alfred de Liechtenstein** • Arhiducesa Maria Margaretha** • Arhiducesa Ludovica** • Arhiducesa Allix** • Josepha, Contesă Clemens de Waldstein-Wartenberg** •Valerie, Margravine de Baden** • Alberta, BaronesăAlexander de Kottwitz-Erdödy** •Theresa, Prințesă Rasso de Bavaria** • Maria Inmakulata, Contesă Reinhart de Hoensbroech** • Arhiducesa Monika, Mrs. Charles de Rambures • Arhiducesa Marie Christine, Mrs. Raymond van der Meide • Arhiducesa Maria, Mrs. Wilhelm de Witt • Margherita, Contesă Benedikt de Piatti
Generație 18
Andrea, Contesă de Neipperg •Monica, Ducesă de Maqueda •Michaela, Contesă Hubertus de Kageneck •Arhiducesa Gabriela, Mrs. Christian Meister •Walburga, Contesă Archibald Douglas • Maria Beatrix, Contesă Riprand de Arco-Zinneberg*** • Isabella, Contesă Andrea Czarnocki-Lucheschi*** • Maria del Pilar, Edle Vollrad-Joachim von Poschinger • Kinga, Baronesă Wolfgang de Erffa • Arhiducesa Marie Adelheid, Mrs. Jaime Corcuerra • Arhiducesa Viridis, Mrs. Karl Dunning-Gribble • Arhiducesa Alexandra, Mrs. Héctor Riesle • Maria Constanza, Prințesă de Auersperg-Trautson • Maria Anna, Prințesă Peter Galitzine • Catharina, Contesă Maximiliano Secco d'Aragona • Arhiducesa Elisabeta, Mrs. James Litchfield • Sophie, Prințesă de Windisch-Grätz • Arhiducesa Marie Christine, Mrs. Clemens Guggenberg • Arhiducesa Marie Bernadette, Mrs. Rupert Wolff** • Arhiducesa Katharina, Mrs. Niall Brooks** • Arhiducesa Alicia** • Arhiducesa Maria Christina** • Arhiducesa Margareta, Mrs. Andreas Baumgartner** • Arhiducesa Marie Valerie, Mrs. Martin Josef Wagner** • Arhiducesa Hedwig** • Arhiducesa Veronika** • Arhiducesa Johanna • Arhiducesa Elisabeta • Arhiducesa Celina • Arhiducesa Maria Floriana • Arhiducesa Sdeía • Arhiducesa Anna Carolina • Arhiducesa Theresa • Arhiducesa Sophie • Arhiducesa Ladislaya
Prințesa Regina de Saxa-Meiningen •Prințesa Margherita de Savoia • Prințesa Anne Eugénie de Arenberg •Prințesa Yolande de Ligne • Contesa Xenia Czernicheva-Besobrasova • Prințesa Anna Gabriele de Wrede • Contesa Helena de Toerring-Jettenbach • Contesa Ludmilla de Gallen • Prințesa Laetitia de Arenberg** • Contesa Margaret Kálnoky von Köröspatak** • Maria Espinosa de los Monteros^^** • Contesa Valerie de Podstatzky-Lichtenstein** • Freiin Eva Antonia von Hdemann** • Prințesa Anna Amelie de Schönburg-Waldenburg** • Contesa Hedwig de Lichem-Löwenburg** • Freiin Edith von Sternbach** • Prințesa Margaret de Hohenberg • Contesa Marie Christine de Hatzfeldt-Dönhdef • Eugenia de Calonge^^ • Freiin Maria Theresia von Gudenus
Elisabetta Maria Rosboch von Wolkenstein*** • Estelle de Saint-Romain^^ • Kathleen Elizabeth Walker^^ • Adélaïde Drapé-Frisch^^ • Adélaïde Drapé-Frisch^^
*de asemenea infantă a Spaniei prin căsătorie **de asemenea Prințesă de Toscana prin căsătorie ***de asemeneaa Prințesă de Modena prin căsătorie ^de asemenea Arhiducesă de Austria prin drepturile ei ^^nu a deținut nici un titlu regal sau nobil prin naștere