In der Antarktis kämpft Mari Illustrious mit dem Evangelion Provisional Unit 05 gegen einen Engel. Mari schafft es, den Engel zu besiegen, aber durch eine Explosion des Engels wird ihr Eva zerstört. Sie schafft es aber, sich mit der Pilotenkapsel in Sicherheit zu bringen. In Japan besucht Shinji Ikari mit seinem Vater Gendo Ikari das Grab von Shinjis Mutter Yui Ikari. Als Shinji und Misato Katsuragi, die ihn zum Treffen begleitet hat, auf dem Rückweg nach Neo-Tokyo 3 sind, geraten sie mitten in den Kampf gegen einen Engel. Asuka Langley Soryu, das gerade aus Europa eingetroffene Second Child, kämpft mit der Evangelion Unit 02 gegen den Engel und besiegt jenen scheinbar mühelos. Nach dem Kampf übergibt Kaji Ryōji, der auch erst seit kurzem in Neo-Tokyo 3 ist, Gendo und seinem Stellvertreter Kozo Fuyutsuki den aus der Bethania-Basis mitgebrachten Schlüssel des Nebukadnezar, der in der Lage sein soll, das Tor zur Vollendung der Menschheit zu öffnen. Später gehen Gendo Ikari und Fuyutsuki zur Tabgha-Mondbasis, um sich von SEELEs Fortschritten bei der Konstruktion von Evangelion Mark.6 zu überzeugen. Während sie auf Landeerlaubnis für ihre Raumfähre warten, begegnen sie Kaworu Nagisa, dem designierten Piloten von Eva 06, der im freien Weltraum auf einem Finger des Evas sitzt. Während Ikari abwesend ist, nähert sich der nächste Engel. Misato entwickelt einen Plan, wonach alle drei Children mit ihren Evas gegen den Engel kämpfen sollen. Asuka ist aber davon überzeugt, den Engel alleine besiegen zu können. Trotzdem schafft sie es nur durch die anderen beiden Children, den Engel zu besiegen. Bei dem Kampf werden Eva 00 und Eva 01 allerdings beschädigt. Als einige Zeit später die NERV-Außenstelle in den USA bei einem Testlauf von Evangelion Unit 04 komplett zerstört wird, wird Evangelion Unit 03 nach Japan gebracht, um dort mit Asuka als Pilotin die erste Aktivierung zu bekommen. Dabei stellt sich heraus, dass Eva 03 von einem Engel übernommen wurde. Shinji soll mit dem reparierten Eva 01 den Eva 03 zerstören, weigert sich jedoch, da er Asuka nicht verletzen will. Daraufhin lässt sein Vater das Dummy-Plug-System aktivieren, damit er vom Hauptquartier aus Eva 01 steuern kann. Es gelingt dem Dummy bald, den Eva zu zerstören und er zerquetscht die Pilotenkapsel, aber Asuka überlebt, allerdings schwer verletzt. Nach diesem Erlebnis will Shinji NERV und Neo-Tokyo 3 verlassen und nie wieder einen Eva steuern. Bald darauf nähert sich der nächste Engel. Mari, die heimlich in Japan ist, steigt in den Eva 02 und stellt sich dem Engel. Allerdings unterliegt der bald schwer beschädigte Eva dem Engel, aber im letzten Moment kommt Rei Ayanami mit Eva 00 hinzu, der jedoch noch nicht voll einsatzfähig ist. Rei versucht den Engel mit einer N2-Rakete zu zerstören, scheitert aber. Shinji, der in einem nahen Schutzraum Zuflucht gesucht hat, wird Zeuge, als der Engel Eva 00 assimiliert. Daraufhin fasst er den Entschluss, Eva 01 wieder zu steuern, um Rei zu befreien. Zusammen mit seinem Eva, der das Dummy die ganze Zeit ablehnt, kann Shinji den Engel schließlich besiegen. Durch seinen festen Willen, Rei zu retten, ermöglicht Shinji seinem Eva, sich aus seinen Fesseln zu befreien und seine wahren Kräfte zu zeigen. Shinji schafft es, Rei aus dem Engel zu befreien und er, Rei und sein Eva verschmelzen miteinander, was den Third Impact auslöst. Nach dem Abspann des Films steigt Kaworu Nagisa in EVA Mark.06 vom Himmel herab und durchbohrt EVA-01 mit einer Lanze; der Evangelion verwandelt sich in seine ursprüngliche Form zurück und der Third Impact ist vorerst abgewendet. Kaworu erklärt, dass er Shinji dieses Mal glücklich machen werde.