Awidyna

Awidyna – białko zwierzęce składające się z czterech łańcuchów polipetydowych, o masie ok. 70 kD, pI ok. 10, obecne w jajach. Wykazuje duże powinowactwo do biotyny (stała dysocjacji K_d kompleksu awidyna-biotyna wynosi 10⁻¹⁵ M) i jest to jedna z najmocniejszych zaobserwowanych w przyrodzie interakcji niekowalencyjnych. Jedna cząsteczka awidyny wiąże cztery cząsteczki biotyny. Kolumny z awidyną immobilizowaną na żelu polimetakrylowym znalazły zastosowanie do oczyszczania peptydów i białek. Występuje w tzw. białku jaj płazów i ptaków. Wiążąc biotynę, stymulującą namnażanie bakterii, chroni jaja przed zakażeniem. Spożywanie dużej ilości surowych jaj może doprowadzić do niedoboru biotyny^[1].

Awidyna to główna glikoproteina produkowana w jajowodzie ptaków, gadów i płazów, która jest gromadzona w białku ich jaj. W białku jaja kurzego awidyna stanowi około 0,05% ogólnej zawartości białek (w przybliżeniu 1,8 mg na jajko). Traktowana jest jako substancja antyodżywcza (antywitamina), gdyż bardzo silnie łączy się z biotyną (witaminą H) w jelicie przewodu pokarmowego. Niewłaściwe wchłanianie biotyny prowadzi do powstawania niedoborów tej witaminy w organizmie. Objawia się to zapaleniem skóry i języka, łojotokiem, wypadaniem włosów, niedokrwistością, podwyższeniem poziomu cholesterolu, depresją, apatią, nadwrażliwością czuciową i ogólnym osłabieniem. Przedłużająca się awitaminoza biotynowa jest przyczyną zmian skórnych, przede wszystkim zmian jej barwy i łuszczenia naskórka. U człowieka niedobór biotyny występuje rzadko. Obróbka cieplna unieczynnia awidynę, dlatego spożywanie ugotowanych jaj kurzych nie przeszkadza w prawidłowej gospodarce biotyny.

Jako że biotyna wchodzi w skład wielu koenzymów jej związanie przez awidynę może prowadzić do zahamowania wielu szlaków metabolicznych. Awidyna tym samym staje się specyficznym inhibitorem tych reakcji i czego efektem może być:

• blokowanie procesu glukogenezy – biotyna jest grupą prostetyczną karboksylazy, która odpowiada za przenoszenie cząsteczki CO₂ na cząsteczkę pirogronianu, czego produktem jest szczawiooctan; związanie biotyny przez awidynę uniemożliwia ten proces;
• blokowanie otrzymywania malonylo-CoA w biosyntezie kwasów tłuszczowych – hamowanie działania karboksylazy acetylo-CoA;
• blokowanie rozkładu leucyny – inhibicja karboksylacji β-metylokrotonylo-CoA do β-metyloglutakonylo-CoA.

To tetrameryczne białko składa się z czterech identycznych podjednostek (homotetramer), z których każda może wiązać jedną cząsteczkę biotyny (witamina H), charakteryzując się przy tym dużym stopniem powinowactwa i specyficzności. Stała dysocjacji kompleksu awidyny z biotyną wynosi K_d=10⁻¹⁵ M, jest to jedno z najmocniejszych znanych oddziaływań niekowalencyjnych.

W swojej tetramerycznej formie awidyna charakteryzuje się masą cząsteczkową w przedziale 66–69 kDa. 10% tej masy obejmuje część węglowodanową złożoną z 4–5 cząsteczek mannozy i trzech fragmentów N-acetyloglukozaminowych. Każdy łańcuch polipeptydowy składa się ze 128 reszt aminokwasów, w obrębie których występuje jeden mostek disulfidowy. W strukturze drugorzędowej wyróżnić można 1 α-helisę i 8 β-struktur. Łańcuchy polipeptydowe nie są związane z sobą wiązaniami kowalencyjnymi. Ze względu na dużą ilość zasadowych reszt aminokwasowych białko to wykazuje charakter zasadowy, a jego punkt izoelektryczny znajduje się przy pH 10.

Awidyna jest bardzo dobrze rozpuszczalna w wodzie i roztworach soli. Jest wysoce niestabilna w warunkach utleniających, szczególnie w obecności promieniowania elektromagnetycznego.

Awidyna została wyizolowana w trzech formach. Jedna z nich, nieglikozylowana forma awidyny, pochodzi z ogólnodostępnego produktu, jednakże nie ma dowodów czy forma ta występuje naturalnie czy też jest efektem procesów produkcyjnych.

Awidyna została wykryta przez Esmonda Emersona Snella (1914–2003). Zauważył on, że kurczęta na diecie złożonej z surowego białka jaja wykazują znaczny deficyt biotyny, pomimo dostarczania tej witaminy z pokarmem. Pozwoliło to na wyciągnięcie wniosku, że w białku jaja znajduje się składnik wiążący biotynę, który Snell potwierdził badając in vitro komórki drożdży. Później Snell wyizolował składnik białka jaja odpowiedzialny za wiązanie biotyny i we współpracy z Paulem Gyorgym udowodnił, że wyizolowana przez niego proteina jest odpowiedzialna za wywoływanie niedoborów biotyny oraz „egg white injury”. Białko to zostało wstępnie nazwane awidalbuminą (dosłownie: głodna albumina) przez zespół naukowców z Uniwersytetu Texas. Nazwa białka została w toku późniejszych badań zmieniona na Awidyna, w związku z jego wysokim powinowactwem do biotyny (awid + biotyna).

Kompleks awidyna-biotyna jest wykorzystywany w naukach biologicznych od lat 70. XX w. Dzięki dużej specyficzności tworzenia się kompleksu awidyna-biotyna i jego trwałości, awidynę wykorzystuje się jako sondę molekularną w wielu układach badawczych. Po odkryciu metod i reagentów do biotynylacji przeciwciał i innych biomolekuł, zastosowanie awidyny znacznie rozszerzyło się, m.in. w biotechnologii. Obecnie awidyna jest szeroko wykorzystywana w badaniach i diagnostyce oraz w przyrządach medycznych i farmaceutykach.

Powinowactwo awidyny do biotyny znajduje zastosowanie wśród wielu analiz biochemicznych, w tym testach Western blot, ELISA, ELISPOT oraz analizie typu pull-down (metoda in vitro, badająca fizyczne oddziaływania między dwoma lub więcej cząsteczkami białek). Awidyna immobilizowana na nośniku stałym jest również wykorzystywana w procesie oczyszczania, jako środek wychwytujący znakowane biotyną przeciwciała, białka, receptory oraz cząsteczki kwasów nukleinowych.

Metody badawcze wykorzystujące właściwości kompleksu awidyna-biotyna:

• Metoda izotopowych rozcieńczeń
• Metoda ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags)
• Metody immunoenzymatyczne:
  • ABC (Avidin-Biotin Complex)
  • LAB (Labelled Avidin-Biotin)

Jako glikoproteina o charakterze zasadowym awidyna może być wykorzystana do ukazania pewnych niespecyficznych oddziaływań w określonych warunkach środowiska. Neutrawidyna, deglikozylowana forma awidyny ze zmodyfikowanymi resztami argininy, wykazuje bardziej neutralną wartość pI. Jest ona wykorzystywana jako alternatywa awidyny, w przypadkach gdy występują problemy z oddziaływaniami niespecyficznymi. Deglikozylowana neutralna forma awidyny jest dostępna handlowo.

Ze względu na wyjątkowo dużą siłę wiązania awidyna-biotyna, dysocjacja powstałego kompleksu wymaga ekstremalnych warunków, które prowadzą również do denaturacji proteiny. Nieodwracalna natura kompleksu awidyna-biotyna może powodować pewne ograniczenia w zastosowaniu tego układu w chromatografii powinowactwa, w której uwalnianie wychwyconego ligandu jest cechą bardzo pożądaną. Naukowcom udało się stworzyć pochodną awidyny o zmniejszonym powinowactwie do biotyny. Uzyskano to przez modyfikację reszty tyrozyny (nitrowanie lub jodowanie) położonej w miejscu aktywnym. Zmodyfikowana awidyna charakteryzuje się silnym wiązaniem biotyny w pH 4, a uwolnienie związanej biotyny następuje w pH 10 i wyższym.

Monomeryczna forma awidyny ze zmniejszonym powinowactwem do biotyny, jest stosowana w wielu ogólnodostępnych żywicach wykorzystywanych w chromatografii powinowactwa. Monomeryczna awidyna powstaje w wyniku działania na immobilizowaną natywną awidynę mocznikiem lub chlorowodorkiem guanidyny (o stężeniu 6–8 M), uzyskuje się wówczas cząsteczkę o wyższej stałej dysocjacji K_d=10⁻⁷M. Umożliwia to uwalnianie związanych cząsteczek z matrycy zawierającej awidynę w łagodniejszych warunkach, nie powodujących denaturacji, używając niskiego stężenia biotyny lub warunków niskiego pH.

• C. Rosano, P. Arosio, M. Bolognesi. The X-ray three-dimensional structure of avidin. „Biomol Eng”. 16 (1-4), s. 5-12, 1999. DOI: 10.1016/S1050-3862(99)00047-9. PMID: 10796979. 
• O. Livnah, EA. Bayer, M. Wilchek, JL. Sussman. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 90 (11), s. 5076-5080, 1993. PMID: 8506353. PMCID: PMC46657. 

• Aleksandra Kramarska: Awidyna. 2000. [dostęp 2016-10-04].

• streptoawidyna