Cromosoma artificial bacteriano
O cromosoma artificial bacteriano (CAB ou, en inglés, BAC) é un vector de clonación usado para clonar fragmentos de ADN (de 100 a 300 kb de tamaño; como media 150 kb)[1] na bacteria Escherichia coli, creado a partir do plásmido factor F encontrado de modo natural na mencionada bacteria[2][3].
É un dos tipos de vectores de clonación coñecidos como "vectores de alta capacidade", entre os que ademais se inclúen os cósmidos, PACs (cromosoma artificial derivado do ADN do bacteriófago P1) e YACs (cromosoma artificial de lévedo), por contraposición cos "vectores de baixa capacidade", como plásmidos, vectores derivados do fago lambda, faxémidos e fósmidos.
Os cromosomas artificiais bacterianos son moi utilizados como vectores de clonación para a construción de xenotecas (bibliotecas xenómicas), como no Proxecto Xenoma Humano. A súa frecuente utilización débese á súa notable capacidade, grande estabilidade e baixa porcentaxe de quimerismo. Tamén se usan no estudo de enfermidades hereditarias e para a clonación de xenomas de axentes infecciosos como virus[4][5][6].
Dado o gran tamaño dos CAB (ou BAC) recombinantes, as estratexias para a súa introdución na célula máis eficientes son as que utilizan a electroporación (aplícanse correntes eléctricas á membrana celular para que se formen poros que permitan o paso de substancias).
Un cromosoma artificial bacteriano típico consta de:
- OriS: orixe de replicación do factor F
- repE: control da replicación do plásmido
- parA, B, C: control da replicación
- CMr: cloranfenicol acetil-transferase (CAT) (xene de resistencia ao cloranfenicol)
- LacZ’: xene cun polilinker (que contén múltiples sitios de restrición) no seu interior. Utilízase para o ensaio de alfa-complementación.
Procedemento de clonación
[editar | editar a fonte]Para realizar a clonación dun xene hai que seguir o seguinte procedemento:
- a) Córtase o vector co encima de restrición HindIII para abrir o plásmido e facelo liñal.
- b) Desfosforílanse os extremos 5’ do vector para evitar a autoligación.
- c) Dixírese a nosa mostra con HindIII ou outro encima compatible. Selecciónanse os fragmentos segundo o seu tamaño por electroforese e purifícanse.
- d) Lévase a cabo a reacción de ligación.
- e) Transfírense os vectores a unha célula por electroporación.
- f) Selección dos clons nun medio con cloranfenicol e X-gal. Son positivos os que sobreviven en cloranfenicol e carecen de actividade de beta-galactosidase.
Notas
[editar | editar a fonte]- ↑ Stone NE, Fan J-B, Willour V, Pennacchio LA, Warrington JA, Hu A, Chapelle A, Lehesjoki A-E, Cox DR, Myers RM (1996). "Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene". Genome Research 6 (3): 218–225. PMID 8963899. doi:10.1101/gr.6.3.218.
- ↑ O'Connor M, Peifer M, Bender W (1989). "Construction of large DNA segments in Escherichia coli". Science 244 (4910): 1307–1312. PMID 2660262. doi:10.1126/science.2660262.
- ↑ Shizuya H, Birren B, Kim U-J, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M (1992). "Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector". Proc Natl Acad Sci USA 89 (18): 8794–8797. PMC 50007. PMID 1528894. doi:10.1073/pnas.89.18.8794.
- ↑ Almazan F, Gonzalez JM, Penzes Z, Izeta A, Calvo E, Plana-Duran J, Enjuanes L (2000). "Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome". Proc Natl Acad Sci USA 97 (10): 5516–5521. PMC 25860. PMID 10805807. doi:10.1073/pnas.97.10.5516.
- ↑ Domi A, Moss B (2002). "Cloning the vaccinia virus genome as a bacterial artificial chromosome in Escherichia coli and recovery of infectious virus in mammalian cells". Proc Natl Acad Sci USA 99 (19): 12415–12420. PMC 129459. PMID 12196634. doi:10.1073/pnas.192420599.
- ↑ Messerle M, Crnkovic I, Hammerschmidt W, Ziegler H, Koszinowski UH (1997). "Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome". Proc Natl Acad Sci USA 94 (26): 14759–14763. PMC 25110. PMID 9405686. doi:10.1073/pnas.94.26.14759.
Véxase tamén
[editar | editar a fonte]Ligazóns externas
[editar | editar a fonte]- Biblioteca BAC
- The Big Bad BAC: Bacterial Artificial Chromosomes — a review from the Science Creative Quarterly
- Empire Genomics (compañía que vende clons de BAC de librarías xenómicas)
- Amplicon Express (compañía que fabrica bibliotecas de BAC personalizadas)
Outros artigos
[editar | editar a fonte]- Cromosoma artificial humano (CAH ou HAC)
- Cromosoma artificial de lévedos (YAC)
