Clonación molecular

Antes da década de 1970, a comprensión da xenética e bioloxía molecular estaba gravemente dificultada pola incapacidade de illar e estudar xenes individuais de organismos complexos. Isto cambiou totalmente cando apareceron os métodos de clonación molecular. Os microbiólogos que trataban de comprender os mecanismos moleculares por medio dos cales as bacterias restrinxían a replicación no seu interior de bacteriófagos, illaron endonucleases de restrición, encimas que podían cortar (clivar) moléculas de ADN cando encontraban nelas certas secuencias de nucleótidos específicas.^[4] Descubriron que os encimas de restrición clivaban moléculas de ADN de lonxitude cromosómica en sitios específicos, e que as seccións específicas dunha molécula longa podían purificarse por fraccionamento por tamaños. Usando un segundo encima chamado ADN ligase, podían unir os fragmentos xerados polos encimas de restrición formando novas combinacións, orixinando o que se denominou ADN recombinante. Ao recombinaren segmentos de ADN de interese cun vector de ADN, como un bacteriófago ou un plásmido, os cales se replican de forma natural dentro da bacteria, os científicos podían producir grandes cantidades de ADN recombinante purificado en cultivos bacterianos. As primeiras moléculas de ADN recombinantes xeráronse e estudáronse en 1972.^[5][6]

A clonación molecular aprovéitase de que a estrutura química do ADN é fundamentalmente a mesma en todos os organismos vivos. Por tanto, se calquera segmento de ADN de calquera organismo se insire nun segmento de ADN que contén as secuencias moleculares que son necesarias para a replicación do ADN, e o ADN recombinante resultante se introduce no organismo no cal se obtiveran ditas secuencias, o ADN alleo replicarase á vez que o ADN da célula hóspede no organismo transxénico.

A clonación molecular é similar á reacción en cadea da polimerase (PCR) en que permite a replicación da secuencia de ADN. A diferenza fundamental entre estes dous métodos é que a clonación molecular implica a replicación do ADN nun organismo vivo, mentres que a PCR replica o ADN nunha solución in vitro, sen células vivas.

En experimentos de clonación convencionais, a clonación de calquera fragmento de ADN implica esencialmente seguir sete pasos: (1) elixir un organismo hóspede e o vector de clonación, (2) preparación do vector de ADN, (3) preparación do ADN que se vai clonar, (4) creación do ADN recombinante, (5) introdución do ADN recombinante no organismo hóspede, (6) selección de organismos que conteñen ADN recombinante, (7) detección e selección dos clons coa inserción do ADN desexado e propiedades biolóxicas procuradas.

Aínda que se pode facer a planificación dunha clonación en calquera editor de texto, e usar ferramentas on line para, por exemplo, o deseño de cebadores de PCR, existe tamén software específico para ese mester. Ese software inclúe por exemplo ApE [1] (de código aberto), DNAStrider [2] (de código aberto), Serial Cloner [3] (gratuíto) e Collagene [4] Arquivado 01 de agosto de 2015 en Wayback Machine. (de código aberto).

Aínda que se usan unha gran variedade de organismos hóspedes e vectores de clonación molecular, a gran maioría dos experimentos de clonación molecular empezan usando unha cepa de laboratorio da bacteria Escherichia coli e un vector de clonación plásmido. Escherichia coli e os vectores plásmidos teñen un uso tan común porque son tecnicamente sofisticados, versátiles, están doadamente dispoñibles, e facilitan un crecemento rápido dos organismos recombinantes requirindo un mínimo equipamento.^[3] Se o ADN que hai que clonar é excepcionalmente grande (de miles a millóns de pares de bases), entón a miúdo o que se elixe é usar un cromosoma artificial bacteriano^[7] ou un cromosoma artificial de lévedo.

Certas aplicacións especializadas poden necesitar sistemas hóspede-vector especializadas. Por exemplo, se os experimentadores queren colleitar unha determinada proteína a partir do organismo recombinante, entón elíxese un vector de expresión que contén sinais apropiados para a transcrición e a tradución no organismo hóspede desexado. Alternativamente, se o que se pretende é a replicación do ADN en diferentes especies (por exemplo, a transferencia de ADN desde bacerias a plantas), pode seleccionarse un vector cun rango de múltiples hóspedes (tamén chamado vector lanzadeira). Porén, na práctica, os experimentos de clonación molecular especializados xeralmente empezan cunha clonación nun plásmido bacteriano, seguida da subclonación no vector especializado.

Sexa cal for a combinación do hóspede e o vector utilizada, o vector case sempre contén catro segmentos de ADN que teñen unha importancia esencial para a súa función e utilidade experimental, que son os seguintes: (1) unha orixe de replicación do ADN, que cómpre para que se replique o vector (e as secuencias recombinantes ligadas a el) dentro do organismo hóspede, (2) un ou máis sitios de recoñecemento de endonuclease de restrición únicos que funcionan como sitios nos que se pode introducir o ADN alleo, (3) un xene que sirva de marcador xenético seleccionable que pode utilizarse para permitir a supervivencia das células que captaron as secuencias vectoras, e (4) un xene adicional que pode usarse para detectar cales células conteñen o ADN alleo.^[3]

O vector de clonación trátase cunha endonuclease de restrición para clivar o ADN no sitio no que se inserirá o ADN alleo. O encima de restrición elíxese para que xere unha configuración no sitio de clivaxe que é compatible coa que hai nos extremos do ADN alleo. Tipicamente, isto faise clivando o ADN vector e o ADN alleo co mesmo encima de restrición, por exemplo EcoRI. A maioría dos vectores modernos conteñen unha variedade de sitios de clivaxe convenientes que son únicos dentro da molécula vector (de modo que o vector só pode ser clivado nun só sitio) e están localizados dentro dun xene (frecuentemente o da beta-galactosidase) cuxa inactivación pode utilizarse para distinguir os organismos recombinantes dos non recombinantes nun paso final do proceso. Para mellorar a proporción de organismos recombinantes e non recombinantes, o vector clivado pode ser tratado cun encima (fosfatase alcalina) que desfosforila os extremos do vector. As moléclas vector con extremos desfosforilados non poden replicarse, e a capacidade de replicación só pode recuperarse se o ADN alleo se integra no sitio de clivaxe.^[8]

Para clonar ADN xenómico, extráese o ADN que se quere clonar do organismo de interese. Pode usarse virtualmene calquera fonte de tecido (mesmo tecidos de animais extintos ^[9]), con tal de que o ADN non estea moi degradado. O ADN é despois purificado usando métodos simples para eliminar as proteínas contaminantes (extracción con fenol), ARN (ribonuclease) e moléculas máis pequenas (precipitación e/ou cromatografía). Tamén se usan a miúdo métodos con reacción en cadea da polimerase (PCR) para a amplificación de secuencias de ADN ou ARN específico (RT-PCR) antes da clonación molecular.

O ADN para os experimentos de clonación pode obterse tamén a partir dun ARN usando o encima transcriptase inversa (é ADN complementario ou clonación de ADNc), ou en forma de ADN sintético (síntese de xenes artificial). A clonación do ADNc utilízase xeralmente para obeter clons representativos da poboación de ARNm das células de interese, mentres que se usa o ADN sintético para obter calquera secuencia precisa definida polo deseñador.

O ADN purificado é despois tratado cun encima de restrición para xerar fragmentos con extremos que poden ser ligados aos do vector. Se é necesario, poden engadirse segmentos de ADN curtos de dobre cadea (linkers) que conteñen os sitios de restrición desexados para crear estruturas nos extremos que sexan compatibles co vector.^[3][8]

A creación doADN recombinante é en moitos aspectos o paso máis simple do proceso de clonación molecular. O ADN preparado a partir do vector e a fonte allea de ADN simplemente se mesturan ás concentracións axeitadas e son expostas a un encima (ADN ligase) que liga covalentemente os extremos. Esta reacción de unión denomínase xeralmente ligación. A mestura de ADN resultante que contén extremos unidos aleatoriamente está lista para a súa introdución no organismo hóspede.

A ADN ligase só recoñece e actúa sobre os extremos de moléculas de ADN lineares, o que normalmente ten como resultado unha complexa mestura de moléculas de ADN con extremos unidos aleatoriamente. Estarán presentes os produtos desexados (ADN vector ligado covalentemente a un ADN alleo), pero tamén aparecerán outras secuencias que non interesan (por exemplo, ADN ligado consigo mesmo, ADN vector ligado consigo mesmo e combinacións de orde superior dos ADN alleo e vector). Nesta mestura complexa faise unha selección nos pasos seguintes do proceso de clonación, despois de que a mestura do ADN se introduce nas células.^[3][8]

A mestura de ADN, previamente manipulada in vitro, será agora introducida de novo nunha célula viva, chamada organismo hóspede. Os métodos usados para introducir o ADN nas células son variados, e o nome que se aplica a este paso depende do métod experimental elixido; por exemplo, transformación, transdución, transfección, electroporación.^[3][8]

Cando o microorganismo capta e replica o ADN do seu ambiente local, o proceso chámase transformación, e as células que están nun estado fisiolóxico no que poden captar o ADN denomínanse competentes.^[10] En cultivos celulares de mamíferos, o proceso análogo de introducir o ADN nas células denomínase normalmente transfección. Tanto a transformación coma a transfección adoitan requirir a preparación das células por medio dun réxime de crecemento especial e un proceso de tratamento químico que variará coa especie concreta e os tipos celulares que se usen.

A electroporación utiliza pulsos eléctricos de alta voltaxe para translocar o ADN a través da membrana plasmática (e da parede celular se está presente).^[11] A diferenza disto, a transdución implica o empaquetamento do ADN en partículas derivadas de virus, e a utilización destas partículas similares a virus para introducir na célula o ADN encapsulado por medio dun proceso que lembra as infecciós virais. Aínda que a electroporación e a transdución son métodos moi especializados, poden ser os métodos máis eficaces para introducir o ADN nas células.

Calquera que sexa o método que se utilice, a introdución do ADN recombinante no organismo hóspede elixido é xeralmente un proceso de baixa eficacia; é dicir, só unha pequena fracción das células captarán realmente o ADN. Os científicos experimentais enfróntanse a este problema realizando unha selección xenética artificial, na cal as células que non captaron o ADN son matadas selectivamente, e só sobreviven aquelas células que poden replicar o ADN activamente que conteñen un xene marcador seleccionable codificado polo vector.^[3][8]

Cando se utilizan células bacterianas como organismos hóspedes, o marcador seleccionable é xeralmente un xene que dá resistencia a un antibiótico, o cal, de non existir ese xene, mataría a célula, que normalmente é a ampicilina. As células que albergan o plásmido sobrevivirán cando se expoñan ao antibiótico, mentres que aquelas que non conseguiron captar as secuencias do plásmido, morren. Cando se usan células de mamífero (por exemplo, células humanas ou de rato), utilízase unha estratexia similar, coa diferenza de que o xene marcador (neste caso codificado tipicamente como parte do casete kanMX) proporciona ás células resistencia ao antibiótico xeneticina.

Os vectores de clonación bacteriana modernos (por exemplo, pUC19 e posteriores derivados como os vectores pGEM) usan o sistema de chequeo azul-branco para distinguir as colonias (clons) de células transxénicas das que conteñen o vector parental (é dicir, o ADN vector que non ten inserida a secuencia recombinante). Nestes vectores, o ADN alleo é inserido nunha secuencia que codifica unha parte esencial da beta-galactosidase, un encima cuxa actividade orixina a formación dunha colonia de cor azul no medio de cultivo que se usa neste proceso. A inserción do ADN alleo na secuencia codificacnte da beta-galactosidase impide o funcionamento deste encima, polo que as colonias que conteñen o ADN transformado permanecen incoloras (brancas). Por tanto, os experimentadores poden identificar doadamente e realizar estudos posteriores sobre os clons bacterianos transxénicos, á vez que desbotan aqueles que non conteñen ADN recombinante.

A poboación total de clons individuiais obtidos nun experimento de clonación molecular denomínase a miúdo libraría de ADN. As librarías poden ser moi complexas (como cando se fai a clonación do ADN xenómico completo dun organismo) ou relativamente simples (como cando se pasa un fragmento de ADN previamente clonado a un plásmido diferente), pero é case sempre necesario examinar varios clons diferentes para asegurarase de que se obtén o construto de ADN desexado. Isto pode conseguirse por medio dunha ampla gama de métodos experimentais, como o uso de hibridacións de ácidos nucleicos, sondas de anticorpos, reacción en cadea da polimerase, análise de fragmentos de restrición e/ou secuenciación do ADN.^[3][8]

A clonación molecular pode proporcionarlle aos científicos unha cantidade practicamente ilimitada de calquera segmento de ADN individual derivado de calquera xenoma. Este material pode utilizarse para unha gran variedade de propósitos, tanto en ciencia biolóxica básica coma aplicada. Algunhas das aplicacións máis importantes son as seguintes:

A clonación molecular levou directamente á dilucidación das secuencias de ADN completas dos xenomas dun número xa grande de especies e á exploración da diversidade xenética dentro dunha especie, traballo que se realizou principalmente determinando as secuencias de ADN de gran cantidade de fragmentos clonados aleatoriamente do xenoma, e a ensamblaxe das secuencias que se solapan.

Ao nivel dos xenes, os clons moleculares úsanse para xerar sondas que se utilizan para examinar como se expresan os xenes, e como esa expresión está relacionada con outros procesos biolóxicos, como o ambiente metabólico, sinais extracelulares, desenvolvemento, aprendizaxe, senescencia e morte celular. Os xenes clonados poden tamén proporcionar ferramentas para examinar a función biolóxica e a importancia de xenes determinados, ao permitiren que os investigadores incactiven os xenes (ver knockout), ou produzan mutacións máis sutís usando mutaxénese rexional ou mutaxénese dirixida a sitio.

A obtención dun clon molecular dun xene pode levar ao desenvolvemento de organismos que producen o produto proteico dos xenes clonados, denominado proteína recombinante. Na práctica, frecuentemente é máis difícil desenvolver un organismo que produza unha forma activa da proteína recombinante en cantidades desexables que clonar o xene. Isto débese a que os sinais moleculares para a expresión dun xene son complexos e variables, e a que o pregamento da proteína, a súa estabilidade e transporte poden ser unha importante complicación.

Moitas proteínas útiles están dispoñibles actualmente como produtos recombinantes. Entre eles están: (1) proteínas útiles medicamente cuxa administración pode corrixir a expresión escasa ou defectuosa (por exemplo, o factor VIII recombinante, que é un factor de coagulación sanguínea deficiente nalgunhas formas de hemofilia,^[12] e a insulina recombinante, usada para tratar algunhas formas de diabetes^[13]), (2) proteínas que poden administrarse como axuda para resolver unha urxencia médica potencialmente mortal (por exemplo, o activador do plasminóxeno dos tecidos, usado para tratar os accidentes cerebrovasculares^[14]), (3) vacinas de subunidades recombinantes, nas cales unha proteína purificada pode utilizarse para inmunizar os pacientes contra doenzas infecciosas, sen expoñelos ao axente infeccioso (por exemplo, a vacina da hepatite B^[15]), e (4) proteínas recombinantes usadas como material estándar para probas de diagnóstico de laboratorio.

Os xenes clonados, unha vez caracterizados e manipulados para proporcionar sinais para unha apropiada expresión, poden ser inseridos nos organismos, xerando organismos transxénicos, tamén chamados organismos modificados xeneticamente (OMX ou GMO). Aínda que a maioría dos OMX se xeran para utilizalos en investigación biolóxica básica (ver por exemplo, os ratos transxénicos), algúns OMX desenvolvéronse para o seu uso comercial, que vai desde o de animais e plantas que producen fármacos e outros compostos, a plantas agrícolas resistentes a herbicidas, e peixes tropicais fluorescentes (GloFish) para acuarios.^[1]

A terapia xénica consiste en subministrar un xene funcional a células que carecen desa función, co obxectivo de corrixir un trastorno xenético ou unha doenza adquirida. A terapia xénica pode ser grosso modo dividida en dúas categorías. A primeira é a alteración de células xerminais, que son o espermatozoide e o óvulo, o que ten como resultado un cambio xenético permanente en todo o organismo e nas xeracións que descendan del. Moitos consideran esta “terapia xénica de liña terminal” pouco ética se é aplicada aos seres humanos.^[16] O segundo tipo de terapia xénica é a “terapia xénica de células somáticas”, que é substancialmente análoga a un transplante de órganos. Neste caso, diríxise o tratamento sobre un ou máis tecidos específicos ou extráese o tecido, engádese o xene ou xenes terapéuticos no laboratorio, e devólvense as células tratadas ao paciente. As probas clínicas da terapia xénica de células somáticas empezaron a finais da década de 1990, principalmente para o tratamento de cancros e trastornos do sangue, fígado e pulmóns.^[17]

Malia a moita publicidade que tivo e o prometedora que é a técnica, a historia da terapia xénica humana caracterizouse por ter un éxito relativamente limitado.^[17] O efecto de introducir un xene nas células a miúdo promove só un alivio parcial ou transitorio dos síntomas da doenza que se quere tratar. Algúns pacientes de ensaios de terapia xénica sufriron consecuencias adversas polo propio tratamento, e houbo casos de mortes. Nalgúns casos, os efectos adversos orixínanse da alteración de xenes esenciais do xenoma do paciente por inactivación insercional. Noutros, os vectores virais usados para a terapia xénica foran contaminados con virus infecciosos. Non obstante, a terapia xénica aínda se considera unha futura área prometedora da medicina, e é unha área na que se está a realizar un significativo esforzo de investigación e desenvolvemento.

• Clonación