Didezoksinukleotid

Didezoksinukleotidi su inhibitori DNK-polimeraza koji produžavaju lanac, a koriste u Sangerovim metodom za sekvenciranje DNK.^[1] Oni su također poznati kao 2' ,3' jer i 2' i 3' pozicije na ribozi nemaju hidroksilne grupe, a skraćeno su označeni kao ddNTPs (ddGTP, ddATP, ddTTP i ddCTP).^[2]

Sangerov metod se koristi za amplifikaciju ciljnog segmenta DNK, tako da se sekvenca DNK može precizno odrediti. Ugradnja ddNTP-a u reakcijske ventile jednostavno se koristi za završetak sinteze rastućeg lanca DNK, što rezultira djelimično repliciranim fragmentima DNK. To je zato što DNK-polimeraza zahtijeva 3' OH grupu rastućeg lanca i 5' fosfatnu grupu nadolazećeg dNTP za stvaranje fosfodiesterske veze.^[2] Ponekad DNK-polimeraza će inkorporirati ddNTP i odsustvo 3' OH grupe će prekinuti reakciju kondenzacije između 5' fosfata (nakon cijepanja pirofosfata) dolaznog nukleotida sa 3' hidroksilne grupe prethodnog nukleotida na rastućoj niti. Ova reakcija kondenzacije bi se normalno dogodila ugradnjom nemodificiranog dNTP-a pomoću DNK-polimeraze. Najjednostavnije rečeno, nukleofilni napad 3' OH grupe dovodi do dodavanja nukleotida u rastući lanac. Odsustvo 3' hidroksilne grupe inhibira ovaj nukleofilni napad, onemogućujući sposobnost DNK-polimeraze da nastavi sa svojom funkcijom.^[2]

Ovo otkriće dovelo je do njegovog odgovarajućeg naziva "Nukleotidi koji završavaju lanac".^[2] Didezoksiribonukleotidi nemaju 3' hidroksilnu grupu, stoga ne može doći do daljeg izduživanja lanca kada je ovaj didezoksinukleotid na lancu. To može dovesti do prekida DNK sekvence. Dakle, ove molekule čine osnovu didezoksi metoda završetka lanca DNK sekvenciranja, o čemu su izvijestili Frederick Sanger i njegov tim u 1977.^[3] kao produžetak ranijih radova.^[4] Sangerov pristup opisan je 2001. godine kao jedan od dva fundamentalna metods za sekvenciranje fragmenata DNK ^[1] (druga je Maxam–Gilbertov metod^[5]) ali Sangerov metod je i "najšire korišten i metod koji koristi većina automatiziranih DNK sekvencera."^[1] Sanger je osvojio svoju drugu Nobelovu nagradu za hemiju 1980., podijelivši je s Walterom Gilbertom ("za njihov doprinos u vezi s određivanjem baznih sekvenci u nukleinskim kiselinama") i sa Paulom Bergom ( "za njegove fundamentalne studije biohemije nukleinskih kiselina, s posebnim osvrtom na rekombinantnu-DNK"),^[6] a i raspravljao o upotrebi didezoksinukleotida u svom Nobelovom predavanju.^[7]

Didezoksinukleotidi su korisni u sekvenciranju DNK u kombinaciji sa elektroforezom. Uzorak DNK koji je podvrgnut PCR-u (lančana reakcija polimeraze) u mješavini koja sadrži sva četiri dezoksinukleotida i jedan didezoksinukleotid će proizvesti niti dužine jednake položaju svakog tipa baze koji nadopunjuje tip koji ima prisutan didezoksinukleotid. taq polimeraza korištena u PCR-u favorizira ddGNTP, što je bio obrazac uočen u različitim istraživanjima.^[8] Odnosno, svaka nukleotidna baza tog određenog tipa ima vjerovatnoću da bude vezana ne za dezoksinukleotid, već radije za didezoksinukleotid, čime se završava elongacija lanca. Stoga, ako se uzorak tada podvrgne elektroforezi, biće prisutna traka za svaku dužinu na kojoj je komplement didezoksinukleotida prisutan. Sada se uobičajeno koristiti fluorescentne didezoksinukleotide, tako da svaki od četiri ima drugačiju fluorescenciju koju može detektovati sekvencer; stoga je potrebna samo jedna reakcija.

U patentiranom metodu, tetrahidrofuran je korišten u rastvaraču koji sadrži 50 g (0,205 mola) uridina (ili, vjerovatno, bilo kojeg nezaštićenog nukleozida), 112 ml (1,03 mola) [[ [Trimetil-ortoformat|metil-ortoformat]] i 10 g (52,6 mmol) paratoluensulfonske kiseline na sobnoj temperaturi uz mešanje. Nakon miješanja na sobnoj temperaturi tokom 24 sata, reakcijska smjesa je izlivena u vodeni rastvor natrij-bikarbonata, nakon čega je 5 puta ekstrahovana hloroformom. Ekstrakt je osušen preko natrij-sulfata i koncentriran da se dobije 49,5 g (0,173 mola) 2',3'-o-metoksimetilideneuridina (prinos, 84,5%). Nakon ove reakcije, produkt primjera uridina 2',3'-o-metoksimetilideneuridin se zatim otopi u 50 ml anhidrida sirćetne kiseline na sobnoj temperaturi, uz miješanje. Rastvor je zagrijan na 140 °C i držan na ovoj temperaturi 5 sati pod refluksom rastvarača. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom, dodano je 50 ml vode i smeša je ekstrahovana 3 puta sa 100 ml hloroforma. Ekstrakt je koncentrovan pod sniženim pritiskom, 30% amonijačne vode da se dobije 82,3% prinosa 2',3'-didezoksi-2',3'-didehidrouridina. Ovaj primjer proizvoda se zatim hidrira da bi se uklonila dvostruka veza, rastvaranjem u metanolu (10 ml) koji sadrži katalizator (vlažni 5% paladij na ugljiku) (400 mg) u atmosferi vodika 1 sat da bi se dobio rezultujući didezoksinukleozid (2 ',3'-didezoksiuridin u ovom slučaju)^[6]. Nukleotid boje koji će se koristiti vjerovatno će se pojaviti tretmanom sa enzimom fosforilacije i biotinizacijom i reakcijom biotinilirane supstance sa bojom. Moguće je da može doći i do trenutne reakcije sa bojom, ali se tvrdi da produženje povećava efikasnost u slučaju upotrebe mutantnog oblika DNK-polimeraza.^[5]

Commons ima datoteke na temu: Didezoksinukleotid