DNA-mikromatrise

DNA-mikromatrise er en teknologi som brukes innen molekylærbiologi og medisin for å måle mengden av bestemte DNA-fragmenter i en biologisk prøve. Teknologien utnytter det at DNA har to tråder eller strenger som er komplementære. Komplementariteten betyr at dersom man har den ene strengen, så kan man alltid utlede den andre. Disse to trådene binder seg til hverandre ved hybridisering, og dette blir utnyttet i mikromatriseteknologien. Fragmenter fra en av DNA-trådene til for eksempel et gen eller en annen del av DNA som man ønsker å måle, festes til mikromatrisen. Disse fragmentene kalles prober. Probene er små, og en mikromatrise kan inneholde fra noen titalls tusen til noen få millioner prober. For å måle genuttrykk i humane prøver brukes prober for alle de ca. 22 000 proteinkodende genene i mennesker. Selve mikromatrisen er vanligvis en fast overflate av glass eller en nylon-membran. Andre typer mikromatriser, som Illumina, bruker mikroskopiske kuler som sitter i små brønner i stedet for den faste overflaten.

Fragmentene man ønsker å måle mengden av varierer etter hva målet med forsøket er. Dersom man er interessert i genuttrykket isoleres mRNA, som så blir reverstranskibert til cDNA. cDNAet blir vanligvis farget med en rød eller grønn fluoreserende farge før de tømmes på mikromatrisen. Her flyter de rundt til de finner sin komplementære probe på matrisen og binder seg fast. Det cDNA som ikke fester seg blir så vasket bort før matrisen skannes. Under skanningen sender man lys ned på matrisen, som gjør at de fluoreserende molekylene lyser opp. Styrken på lyssignalet gir et mål på mengden av cDNA som har bundet seg.

Der finnes mange forskjellige typer mikromatriser. DNA-mikromatriser skiller seg fra de andre typene ved at de bruker DNA som deteksjonssystem.

DNA-mikromatriseteknologien er sprunget ut fra Southern blot, som er en molekylærbiologisk metode som brukes til å påvise bestemte DNA-fragmenter i en prøve. Den første samlingen av spesifikke DNA-fragmenter brukt til profilering av genuttrykk ble beskrevet i 1987 ^[1] i en studie hvor de ønsket å identifiserte gener hvis genuttrykk moduleres av interferon. De første DNA-mikromatrisene ble laget ved å trykke cDNA ned på filterpapir. De første mikromatrisene for profilering av genuttrykk ble rapportert i 1995 ^[2], og komplett eukaryotisk genom (Saccharomyces cerevisiae) på en mikromatrise ble publisert i 1997. ^[3]

DNA-mikromatriser kan brukes til å detektere DNA (som i Comparativ Genomic Hybridisation) eller RNA (som regel cDNA etter reverstranskripsjon).

Siden en mikromatrise inneholder titusener av prober gjør man i praksis titusener av tester parallelt. Mikromatrisene har derfor ført til at det er mulig å se sammenhenger mellom forskjellige gener som det ikke var mulig å oppdage tidligere. DNA-mikromatriser har i tillegg akselerert mange typer metoder:

Anvendelse av mikromatriser i forskningen har skapt flere statistiske og bioinformatiske utfordringer:

• Eksperimentell planlegging
• Standardisering
• Statistisk analyse
• Forholdet mellom prober og gener (Nøyaktighet og presisjon)
• Datamengde og offentilig tilgjengelighet

Kompleksiteten av genuttryksdata gjør at det er viktig å planlegge forsøket nøye for at det skal være mulig å dra biologiske slutninger som er statistisk gyldige. Mye av grunnen til dette er en sensitiv teknologi sammen med mengden data som gjør at systematiske støy i dataene blir tydeligere. Eksperimentell planlegging i denne sammenhengen er svært omfattende og dekker alt fra design av prober og produksjon av matrisene til prøvebehandling, prøvetaking, rensing av RNA samt stegene som omfatter selve mikromatriseforsøket.

Sammenligning av resultater fra forskjellige mikromatriseforsøk kan ofte by på store utfordringer på grunn av manglende standarder både når det gjelder produksjon av matriser, protokoller brukt under forsøket, og et hav av analysemetoder som kan brukes i etterkant. Dette byr på bioinformatiske utfordringer og flere prosjekter er satt igang for gjøre det lettere å utveksle data, samt analysere data som kommer fra forskjellige plattformer:

• Microarray Gene Expression Data (MGED) Society Arkivert 3. mars 2005 hos Wayback Machine. har utviklet standarder for representering og beskrivelse av mikromatrisedata. For eksempel så er "Minimal Information About a Microarray Experiment" (MIAME)^[6] er en sjekkliste som hjelper til med å definere nivået av detaljer som bør publiseres sammen med resultatene. Mange tidsskrifter krever at denne standarden er fulgt før de vil publisere data som inneholder mikromatriseresultater.
• "MicroArray Quality Control (MAQC) Project" er et internasjonalt prosjekt ledet av Food and Drug Administration i USA, som gikk ut på at de samme prøvene ble testet i mange forskjellige laboratorier på matriser fra mange forskjellige produsenter. Prosjektet ble startet fordi mange mikromatriseforsøk rapporterte motsigende resultater, og det ble stilt spørsmål til hvor mye man kunne stole på mikromatriseforesøkene. Resultatet fra denne studien viste at mikromatriseresultater er reproduserbare både på tvers av forskjellige laboratorier og på matriser fra forskjellige produsenter.^[7]

Før man analyserer data fra forskjellige fysiske mikromatriser må man som regel normalisere dataene for å sikre at de er sammenlignbare. Der er flere måter å normalisere dataene på, og det kan noen ganger være vanskelig å vite hvilke metoder som er best å bruke. Dersom man har brukt det som kalles "Spike-ins", som er eksternt DNA fra feks plante dersom man jobber med DNA fra menneske eller dyr, så kan man se på hvordan dataene fra dette DNAet oppfører seg under diverse normaliseringsmetoder. Man tilsetter det eksterne DNAet i kjente mengder, sånn at det er mulig å sammenligne på tvers av mikromatriser.

Når man gjør statistiske analyser beregnes ofte en p-verdi som sier noe om sannsynligheten for å få dette resultatet ved en tilfeldighet. Normalt sett gjør man noen få tester om gangen. Det som er litt spesielt når det gjelder de statistiske analysene av mikromatrisedata er at man gjør mange tester samtidig. Når man gjør mange tester så øker sannsynligheten for at man gjør et funn, helt tilfeldig. P-verdiene blir derfor ofte justert for å ta høyde for multippel testing problematikken.

Forholdet mellom probene og genene de er forventet å detektere kan være noe problematisk. Noen mRNA molekyler kan binde seg til flere prober enn de er tenkt å hybridisere til. Dette kalles krysshybridisering. Disse mRNA molekylene vil da bidra til signal for prober som egentlig er ment å skulle detektere et helt annet mRNA molekyl.

De to viktigste datavarehusene for mikromatrisedata er ArrayExpress og Gene Expression Omnibus (GEO). Begge disse har funksjoner som gjør det mulig å søke etter bestemte gener på tvers av forskjellig mikromatriseforsøk, eller man kan laste ned dataene som er brukt i forskjellige publikasjoner for å se om man greier å reprodusere selve analysen. Mange tidsskrifter krever at dataene gjøres offentlig tilgjengelig, og da ofte at de gjøres tilgjengelig gjennom en av disse datavarehusene.

• Genuttrykk
• Genuttrykksprofilering

• Norwegian Microarray Consortium Arkivert 16. august 2006 hos Wayback Machine.