Преглед на кодот на Функционално клонирање

Немате дозвола за уредување на оваа страница, од следнава причина:
Вашата IP-адреса се наоѓа во опсег блокиран на сите Викимедиини викија.
Блокот го зададе ‪EPIC‬. Наведената причина гласи Open proxy/Webhost: See the help page if you are affected.
Почнува: 09:48, 2 јули 2024
Истекува: 09:48, 2 јули 2025
Вашата тековна IP-адреса е 206.189.44.186. Блокираниот опсег е 206.189.32.0/20.
Вклучете ги сите горенаведени поединости кога се обраќате. Ако сметате дека сте блокирани по грешка, дополнителни информации и напатствија ќе најдете во глобалното правило Без отворени застапници.
Во спротивно, за да поразговарате за блокот, поднесете барање за разгледување на Мета. Можете и да пишете во VRT-редицата на надзорниците на stewards@wikimedia.org, притоа вклучувајќи ги сите гореспоменати поединости.
Можете да го погледнете и копирате кодот на оваа страница.
[[Податотека:Amp_replica_plate.png|мини|438x438пкс| Работен тек за користење на селекција во [[опит]] за функционално клонирање. Овде се избирани само гени кои обезбедуваат отпорност на [[ампицилин]].]]
'''Функционално клонирање''' ― техника на молекуларно клонирање која се потпира на претходно знаење за [[Првична структура на белковините|секвенцата]] или [[Белковина|функцијата]] на кодираната [[белковина]] за идентификација на [[ген]]ите.<ref name=":6"/><ref name=":8" /><ref name=":10">{{Наведена книга|url=https://books.google.com/books?id=BU-mUeFr_tMC&q=functional+cloning+anemia|title=Fanconi Anemia: A Paradigmatic Disease for the Understanding of Cancer and Aging|last=Schindler-Hoehn|last2=Hoehn|first2=Holger|date=2007-01-01|publisher=Karger Medical and Scientific Publishers|isbn=9783805582773|language=en}}</ref> Во оваа анализа, геномска библиотека или библиотека на комплементарна ДНК е проверувана за да биде идентификувана генетската секвенца на белковина од интерес. Изразувачките библиотеки на комплементарна ДНК може да бидат видени со [[Антитело|антитела]] специфични за белковината  од интерес или може да се потпрат на селекција преку белковинската функција.<ref name=":6" /> Историски гледано, [[Аминокиселина|аминокиселинската]] секвенца на белковината била користена за да се подготват дегенерирани олигонуклеотиди кои потоа биле испитани во библиотеката за да биде идентификуван генот што ја кодира белковината од интерес.<ref name=":8">{{Наведена книга|title=Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology|date=2006|publisher=Oxford University Press|others=Cammack, Richard, Ph. D.|isbn=9780198529170|edition=Rev.|location=Oxford|oclc=65467611}}</ref><ref name=":10" /> Откако ќе бидат идентификувани кандидатските клонови кои го носат генот од интерес, тие се [[Секвенцирање на ДНК|секвенционираат]] и нивниот идентитет е потврден. Овој метод на клонирање им овозможува на истражувачите да прегледаат цели [[геном]]и без претходно знаење за локацијата на генот или генетската секвенца.<ref name=":6" />

Оваа техника може да биде користена за да бидат идентификувани гени кои кодираат слични белковини од еден организам до друг.<ref>{{Наведено списание|last=Skjøt|first=M.|last2=Kauppinen|first2=S.|last3=Kofod|first3=L.|last4=Fuglsang|first4=C.|last5=Pauly|first5=M.|last6=Dalbøge|first6=H.|last7=Andersen|first7=L.|date=2001-07-01|title=Functional cloning of an endo-arabinanase from Aspergillus aculeatus and its heterologous expression in A. oryzae and tobacco|journal=Molecular Genetics and Genomics|language=en|volume=265|issue=5|pages=913–921|doi=10.1007/s004380100489|issn=1617-4615|pmid=11523809}}</ref> Слично на тоа, оваа техника може да биде поврзана со метагеномски библиотеки за да бидат идентификувани нови гени и белковини кои вршат слични функции, како што е идентификација на нови [[Антибиотик|антибиотици]] со проверка за активност на бета-лактамаза или избирање за раст во присуство на пеницилин.<ref name=":2">{{Наведено списание|last=Allen|first=Heather K|last2=Moe|first2=Luke A|last3=Rodbumrer|first3=Jitsupang|last4=Gaarder|first4=Andra|last5=Handelsman|first5=Jo|date=2008-10-09|title=Functional metagenomics reveals diverse β-lactamases in a remote Alaskan soil|journal=The ISME Journal|language=En|volume=3|issue=2|pages=243–251|doi=10.1038/ismej.2008.86|issn=1751-7370|pmid=18843302|doi-access=free}}</ref>

== Опитен работен тек ==
[[Податотека:Genomic_Library_in_S._cerevisiae.jpg|мини| Геномска библиотека во домаќинот ''[[Лебен квасец|Saccharomyces cerevisiae]]''.]]
Работниот тек на [[опит]]от за функционално клонирање варира во зависност од изворот на генетскиот материјал, степенот на претходно познавање на [[белковина]]та или генот од интерес и способноста за проверка на белковинската функција. Општо земено, опитот за функционално клонирање се состои од четири чекори: 1) собирање примероци, 2) подготовка на библиотеката, 3) скрининг или селекција и 4) [[Секвенцирање на ДНК|секвенционирање]].

=== Собирање примероци ===
Генетскиот материјал е собиран од одреден тип на клетка, организам или примерок од околината релевантен за биолошкото прашање. Во функционалното клонирање, [[Информациска РНК|информациската РНК]] најчесто е изолирана и комплементарната ДНК е подготвувана од изолираната информациска РНК (екстракција на РНК).<ref>{{Наведено списание|last=Shyjan|first=Anne M.|last2=Heldin|first2=Paraskevi|last3=Butcher|first3=Eugene C.|last4=Yoshino|first4=Tadashi|last5=Briskin|first5=Michael J.|date=1996-09-20|title=Functional Cloning of the cDNA for a Human Hyaluronan Synthase|journal=Journal of Biological Chemistry|language=en|volume=271|issue=38|pages=23395–23399|doi=10.1074/jbc.271.38.23395|issn=0021-9258|pmid=8798544|doi-access=free}}</ref> Во одредени околности, геномската ДНК може да биде изолирана, особено кога примероците од околината се користени како извор на генетски материјал.<ref name=":6"/>

=== Подготовка на библиотека ===
Ако почетниот материјал е геномска ДНК, ДНК е вадена за да бидат добиени фрагменти со соодветна должина за векторот на избор. Фрагментите од [[ДНК]] или комплементарна ДНК потоа се третирани со [[Рестрикционен ензим|рестриктивни ендонуклеази]] и се врзуваани со [[плазмид]] или [[хромозом]]ски вектори. Во случај на анализи кои ја проверуваат белковината или неговата функција, користен е изразувачки вектор за да биде осигурано дека генскиот производ е изразен. Изборот на векторот ќе зависи од потеклото на ДНК или комплементарна ДНК за да биде обезбедено правилно изразување и да биде осигурано дека кодираниот [[ген]] ќе падне во границите на големината на вметнувањето на векторот.<ref name=":9"/>

Изборот на домаќин е важен за да биде осигура дека употребата на кодонот ќе биде слична на [[Организам|организмот]]-дарител. Домаќинот исто така ќе треба да гарантира дека ќе се случат соодветни послепреведувачки модификации и преклопување на белковините за да биде овозможено правилно функционирање на изразените белковини.<ref name=":9"/>

=== Проверка или селекција ===
Методот на проверка на подготвените геномски или библиотеки на комплементарна [[ДНК]] за [[ген]]от од интерес е многу променлив во зависност од [[опит]]ниот дизајн и биолошкото прашање. Еден метод на проверка е да бидат испитани колониите преку Саутерновиот метод со дегенерирани олигонуклеотиди подготвени од [[Аминокиселина|аминокиселинската]] секвенца на бараната [[белковина]].<ref name=":7">{{Наведено списание|last=Mølhøj|first=Michael|last2=Verma|first2=Rajeev|last3=Reiter|first3=Wolf-Dieter|date=2004-07-01|title=The Biosynthesis of d-Galacturonate in Plants. Functional Cloning and Characterization of a Membrane-Anchored UDP-d-Glucuronate 4-Epimerase from Arabidopsis|journal=Plant Physiology|language=en|volume=135|issue=3|pages=1221–1230|doi=10.1104/pp.104.043745|issn=0032-0889|pmc=519042|pmid=15247385}}</ref> Во библиотеките за изразување, белковината од интерес може да биде идентификувана со проверка со [[антитело]] специфично за бараната белковина преку западниот Саутернов метод за да бидат идентификувани колониите кои го носат генот од интерес. Во други околности, специфична анализа може да биде користена за проверка или избор на активноста на белковината.<ref name=":6">{{Наведено списание|last=Lam|first=Kathy N.|last2=Cheng|first2=Jiujun|last3=Engel|first3=Katja|last4=Neufeld|first4=Josh D.|last5=Charles|first5=Trevor C.|date=2015|title=Current and future resources for functional metagenomics|journal=Frontiers in Microbiology|language=en|volume=6|pages=1196|doi=10.3389/fmicb.2015.01196|issn=1664-302X|pmc=4625089|pmid=26579102|doi-access=free}}</ref> На пример, гените кои даваат [[Антибиотска отпорност|отпорност на антибиотици]] може да бидат избрани со одгледување на колониите од библиотеката на медиум што содржи одреден [[антибиотик]].<ref name=":2"/> Друг пример е проверка за ензимска активност со инкубирање со супстрат кој е катализиран до колориметриско [[соединение]] кое лесно може да биде виден.<ref>{{Наведено списание|last=Cheng|first=Jiujun|last2=Romantsov|first2=Tatyana|last3=Engel|first3=Katja|last4=Doxey|first4=Andrew C.|last5=Rose|first5=David R.|last6=Neufeld|first6=Josh D.|last7=Charles|first7=Trevor C.|date=2017-03-08|title=Functional metagenomics reveals novel β-galactosidases not predictable from gene sequences|journal=PLOS ONE|language=en|volume=12|issue=3|pages=e0172545|bibcode=2017PLoSO..1272545C|doi=10.1371/journal.pone.0172545|issn=1932-6203|pmc=5342196|pmid=28273103|doi-access=free}}</ref>

=== Секвенционирање ===
{{Известување најгоре|{{See also|Секвенцирање на ДНК}}}}
Последниот чекор од функционалното клонирање е да биде [[Секвенцирање на ДНК|секвенционирана]] [[ДНК]] или комплементарна ДНК од клоновите кои биле успешно идентификувани во проверката или чекорот на селекција. Редоследот потоа може да биде означен и да биде користен за надолни примени, како што се изразување на белковини и прочистување за [[Индустрија|индустриски]] примени.<ref>{{Наведено списание|last=Vester|first=Jan Kjølhede|last2=Glaring|first2=Mikkel Andreas|last3=Stougaard|first3=Peter|date=2014-05-20|title=Discovery of novel enzymes with industrial potential from a cold and alkaline environment by a combination of functional metagenomics and culturing|journal=Microbial Cell Factories|volume=13|pages=72|doi=10.1186/1475-2859-13-72|issn=1475-2859|pmc=4035831|pmid=24886068|doi-access=free}}</ref>

== Предности ==
Предностите на функционалното клонирање ја вклучуваат можноста за проверка на нови [[гени]] со посакувана примена во [[Организам|организми]] кои не можат да бидат одгледувани, особено од [[Бактерии|бактериски]] или [[вирус]]ни примероци.<ref name=":6"/> Дополнително, гените кои кодираат [[белковини]] со сродни функции може да бидат идентификувани кога има мала сличност во секвенцата поради способноста да биде направена проверка само на белковинската функција. Функционалното клонирање овозможува идентификација на генот без претходно знаење за [[геном]]ската секвенца на организмот или положбата на генот во геномот.<ref name=":6" />

== Ограничувања ==
Како и со другите техники на клонирање, изборот на вектор и домаќин влијае на успехот на идентификацијата на [[ген]]ите преку функционално клонирање поради пристрасност кон клонирање. Векторот мора да има големина на внес која ќе ја смести целата секвенца на [[ДНК]] на изразената [[белковина]]. Дополнително, во изразувачките вектори, [[Промотор (генетика)|промоторите]] и терминаторите мора да функционираат во рамките на избраниот [[организам]] домаќин. Изборот на домаќинот може да влијае на [[Транскрипција (генетика)|транскрипцијата]] и [[Транслација (биологија)|преводот]] поради различната употреба на кодони, транскрипциските и преведувачките машини или послепреведувачките изменувања во домаќинот.<ref name=":6"/><ref name=":9">{{Наведено списание|last=Lodish|first=Harvey|last2=Berk|first2=Arnold|last3=Zipursky|first3=S. Lawrence|last4=Matsudaira|first4=Paul|last5=Baltimore|first5=David|last6=Darnell|first6=James|date=2000|title=Constructing DNA Libraries with λ Phage and Other Cloning Vectors|url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21696/|language=en}}</ref>

Други ограничувања вклучуваат трудоинтензивна подготовка на библиотеката и потенцијални проверки кои можат да бидат и скапи и одземаат многу време.<ref name=":9"/>

== Алтернативни пристапи ==

=== Положбено клонирање ===
[[Податотека:Choosing_a_cloning_method.png|мини|336x336пкс| Табела на тек за да биде одлучено за опт��малната стратегија за клонирање.]]
Положбеното клонирање е друга техника на [[молекула]]рно клонирање за идентификација на [[ген]] од интерес. Овој метод користи точно [[хромозом]]ско место наместо функција за да ја води идентификацијата на гените.<ref name=":0">{{Наведено списание|last=Puliti|first=Aldamaria|last2=Caridi|first2=Gianluca|last3=Ravazzolo|first3=Roberto|last4=Ghiggeri|first4=Gian Marco|date=2007-12-01|title=Teaching molecular genetics: chapter 4—positional cloning of genetic disorders|journal=Pediatric Nephrology|language=en|volume=22|issue=12|pages=2023–2029|doi=10.1007/s00467-007-0548-5|issn=0931-041X|pmc=2908434|pmid=17661092}}</ref> Поради ова, овој метод е насочен на целиот генетски материјал во хромозомскиот [[Локус (генетика)|локус]] и не прави претпоставки за функцијата.<ref name=":0" /> Кај [[Моделен организам|моделните организми]] како што се глувците или [[квасец]]от, овој метод е користен почесто бидејќи информациите за положбата на генот од интерес може да бидат добиени од [[Секвенцирање на ДНК|секвенционираниот геном]]. Сепак, овој метод станува многу понезгоден кога информациите за секвенцата не се достапни. Во овој случај, може да биде користена и анализа на поврзување.<ref name=":0" /> Функционалното клонирање од друга страна полесно е користемо кај организми како што се бактериски патогени кои се остварливи, но не можат да бидат одгледувани и каде што податоците за секвенцата не се достапни, но генската хомологија или [[Белковина|белковинската]] функција е сè уште од интерес.<ref name=":0" />

Начин да биде направена разлика помеѓу функционалното и положбеното клонирање е да бидат видени гените како зборови. Функционалното клонирање е како користење на речник за барање зборови и избирање нови зборови кои имаат исти значења (или функции).<ref name=":1">{{Наведено списание|last=Rand|first=Elizabeth B.|date=1998-02-01|title=The Genetic Basis of the Alagille Syndrome|journal=Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition|language=ENGLISH|volume=26|issue=2|pages=234–236|doi=10.1097/00005176-199802000-00024|issn=0277-2116|pmid=9481647}}</ref> Положбеното клонирање е повеќе како да изберете одредена страница од речник и потоа да ја прелистувате само таа страница за какви било зборови од интерес.<ref name=":1" />

=== Сметачки определена хомологија ===
Со доаѓањето на [[технологијата]] за [[Секвенцирање на ДНК|секвенционирање]] станува поевтина и поевтина, сега е поизводливо да биде секвенциониран непознат [[геном]] и потоа сметачки да биде одреден [[Хомологија (биологија)|хомологијата]] наместо проверка.<ref>{{Наведено списание|last=Shendure|first=Jay|last2=Balasubramanian|first2=Shankar|last3=Church|first3=George M.|last4=Gilbert|first4=Walter|last5=Rogers|first5=Jane|last6=Schloss|first6=Jeffery A.|last7=Waterston|first7=Robert H.|date=2017|title=DNA sequencing at 40: past, present and future|journal=Nature|language=En|volume=550|issue=7676|pages=345–353|bibcode=2017Natur.550..345S|doi=10.1038/nature24286|issn=1476-4687|pmid=29019985}}</ref> Ова ја носи дополнителната придобивка од можноста за проверка на повеќе гени од интерес во исто време и го намалува времето на [[опит]]ување. Тоа, исто така, овозможува да бидат избегнати трудоинтензивните процедури за клонирање.<ref>{{Наведена мрежна страница|url=https://www.illumina.com/areas-of-interest/microbiology/microbial-sequencing-methods/microbial-whole-genome-sequencing.html|title=Microbial Whole-Genome Sequencing|work=www.illumina.com|accessdate=10 февруари 2024}}</ref> Меѓутоа, ако се оди по овој пат, има и други предрасуди и пречки што треба да бидат земани во предвид. Со користење на секвенционирани податоци, може да биде направена проверка само врз основа на хомологија.<ref name=":6"/> Така, пристапот заснован на функции овозможува откривање на нови [[ензими]] чии функции не би биле предвидени само врз основа на секвенцата на ДНК.<ref name=":6" /> Затоа, иако секвенционирањето опитно е помалку трудоинтензивно, исто така може да доведе до пропуштени гени од интерес поради различната хомологија на секвенцата во гените со сродна функција.

=== Гибсоново составување ===
Гибсонското склопување е брз метод на клонирање кој користи три примарни [[ензими]]; 5' [[егзонуклеаза]], полимераза и лигаза.<ref name=":11">{{Наведено списание|last=Wang|first=Jia-Wang|last2=Wang|first2=Amy|last3=Li|first3=Kunyu|last4=Wang|first4=Bangmei|last5=Jin|first5=Shunqian|last6=Reiser|first6=Michelle|last7=Lockey|first7=Richard F|year=2015|title=CRISPR/Cas9 nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning|url=http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2015/April/CRISPRCas9-nuclease-cleavage-combined-with-Gibson-assembly-for-seamless-cloning/biotechniques-357771.html|journal=BioTechniques|volume=58|issue=4|pages=161–70|doi=10.2144/000114261|pmid=25861928|doi-access=free|access-date=2024-02-10|archive-date=2017-01-23|archive-url=https://web.archive.org/web/20170123122722/http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2015/April/CRISPRCas9-nuclease-cleavage-combined-with-Gibson-assembly-for-seamless-cloning/biotechniques-357771.html|url-status=dead}}</ref> Егзонуклеазата го вари 5' крајот на фрагментите на [[ДНК]] оставајќи 3' настрешница.<ref name=":11" /> Ако има значителна хомологија (20-40 bp) на секој крај од внесот на ДНК, може да биде анелирано со комплементарен столб.<ref name=":11" /> После тоа, полимеразата може да ги пополни празнините додека лигазата ги спојува процепите на крајот.<ref name=":11" /> Овој метод во голема мера ја зголемува стапката на клонирање и стапката на успех на клонирање во векторски столб.<ref name=":11" /> Сепак, потребно е фрагментот на ДНК да има значителна хомологија со [[плазмид]]от.<ref name=":11" /> Поради оваа причина, знаењето за секвенцата што е клонирана мора да биде знаено претходно. Ова не е услов со функционалното клонирање.

=== Клонирање засновано на изомераза ===
Клонирањето засновано на изомераза е метод на клонирање што користи [[Taq полимераза]].<ref name=":12">{{Наведено списание|last=Xu|first=Ruqiang|last2=Qingshun|first2=Li Quinn|date=2008-01-22|title=Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway® TOPO vector system|journal=Plant Methods|volume=4|pages=4|doi=10.1186/1746-4811-4-4|issn=1746-4811|pmc=2257932|pmid=18211693|doi-access=free}}</ref> Ова е затоа што Taq остава единечен аденозин настрешница на 3'-крајот на производите за реакција на [[Полимераза верижна реакција|полимеразната верижна реакција]].<ref name=":12" /> Користејќи го ова знаење, 'рбетот со 5' [[тимин]] надвиснат може да бидат користени за цели на клонирање.<ref name=":12" /> Во овој случај мора да биде знаено знаењето за фрагментот што е клониран за да може да бидат направени прајмери на полимеразна верижна реакција за него и бројот на вектори што одговараат со клонирањето со изомераза е релативно мал. Сепак, тоа дава предност што за реакциите се потребни само околу 5 минути.<ref name=":12" />

=== Клонирање со рекомбинација на влез ===
Клонирањето со рекомбинација на влезот е метод на клонирање во кој фрагмент на [[ДНК]] се преместува од еден [[плазмид]]ен столб во друг преку единствен хомологен настан на рекомбинација.<ref name=":13">{{Наведено списание|last=Petersen|first=Lena K.|last2=Stowers|first2=R. Steven|date=2011-09-09|title=A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit|journal=PLOS ONE|language=en|volume=6|issue=9|pages=e24531|bibcode=2011PLoSO...624531P|doi=10.1371/journal.pone.0024531|issn=1932-6203|pmc=3170369|pmid=21931740|doi-access=free}}</ref> Меѓутоа, за да функционира овој метод, фрагментот на ДНК од интерес мора да биде опкружен со места за рекомбинација.<ref name=":13" /> Иако овој метод не е строго алтернатива, тој овозможува движење на фрагментите на ДНК од еден плазмид до друг побрзо отколку создавање на сосема нова [[геном]]ска библиотека. Причината поради која овој метод може да биде користен во врска со функционалното клонирање е да биде ставена библиотека под различен [[Промотор (генетика)|промотор]] или на столб со различен маркер за селекција.<ref name=":13" /> Ова може да биде корисно ако поединецот сака да проба функционално клонирање во широк опсег на [[бактерии]] за да се обиде да се избори со проблемот со пристрасност на кодонот.<ref name=":9"/><ref name=":13" />

== Примени ==

=== Утврдување на хомологија во животната средина ===
[[Метагеномика]]та е едно од најголемите полиња што најчесто користи функционално клонирање. Метагеномиката го проучува целиот генетски материјал од специфичен примерок од околината, како што е микробиомот на цревата или [[Езеро|езерската]] вода.<ref name=":6"/> Создавани се функционални библиотеки кои содржат фрагменти на ДНК од околината.<ref name=":6" /> Бидејќи првобитната [[бактерија]] од која потекнува секвенцата на ДНК не може лесно да биде откриена, создавањето метагеномски функционални библиотеки има предности. Помалку од 1% од сите бактерии лесно се одгледуваат во [[лабораторија]], оставајќи голем процент на бактерии кои не можат да бидат одгледуваат.<ref>{{Наведено списание|last=Amann|first=Rudolf|year=2000|title=Who is out there? Microbial Aspects of Biodiversity|journal=Systematic and Applied Microbiology|volume=23|issue=1|pages=1–8|doi=10.1016/s0723-2020(00)80039-9|pmid=10879972}}</ref> Со користење на функционални библиотеки, генските функции на неодгледани бактерии сè уште може да бидат проучувани.<ref name=":6" /> Понатаму, овие некултурни микроби обезбедуваат извор за откривање на нови [[ензими]] со [[Биотехнологија|биотехнолошки]] примени. Некои нови [[белковини]] кои се откриени од морските средини вклучуваат ензими како што се протеази, амилази, липази, хитинази, деоксирибонуклеази и фосфатази.<ref>{{Наведено списание|last=Kennedy|first=Jonathan|last2=Marchesi|first2=Julian R.|last3=Dobson|first3=Alan DW|date=2008-08-21|title=Marine metagenomics: strategies for the discovery of novel enzymes with biotechnological applications from marine environments|journal=Microbial Cell Factories|volume=7|pages=27|doi=10.1186/1475-2859-7-27|issn=1475-2859|pmc=2538500|pmid=18717988|doi-access=free}}</ref>

=== Одредување на хомологија кај познат вид ===
Постојат ситуации во кои е императив да биде утврден дали [[ген]]от хомолог од еден извор е присутен во друг [[организам]]. На пример, идентификација на нови [[ДНК-полимераза|ДНК-полимерази]] за реакции на [[Полимераза верижна реакција|полимеразна верижна реакција]] кои синтетизираат [[молекули]] на [[ДНК]] од деоксирибонуклеотиди.<ref name=":3">{{Наведено списание|last=Garibyan|first=Lilit|last2=Avashia|first2=Nidhi|year=2013|title=Polymerase Chain Reaction|journal=Journal of Investigative Dermatology|volume=133|issue=3|pages=1–4|doi=10.1038/jid.2013.1|pmc=4102308|pmid=23399825}}</ref> Додека [[Човек|човечката]] полимераза оптимално фу��кционира на 37&nbsp;°C, ДНК не се денатурира до 94-98&nbsp;°C.<ref name=":3" /> Ова претставува проблем бидејќи на овие температури човечката ДНК-полимераза би денатурирала за време на чекорот на денатурација на полимеразната верижна реакција што резултира со нефункционален полимеразна белковина и неуспешна полимеразна верижна реакција. За борба против ова може да биде користена ДНК-полимераза од термофил, или бактерија која расте на високи температури. Пример е [[Taq полимераза]]та која доаѓа од термофилната [[бактерија]] ''Thermus aquaticus''.<ref name=":3" /> Може да биде поставена функционална клонирачка контрола за да бидат пронајдени хомологни полимерази кои имаат дополнителна предност што се термостабилни на високи температури.

Имајќи го ова на ум, 3173 полимераза, друг полимеразен ензим, кој сега најчесто е користен во реакциите на обратната транскрипција на полимеразна верижна реакција, бил откриен користејќи ја горната теорија.<ref name=":5">{{Наведено списание|last=Moser|first=Michael J.|last2=DiFrancesco|first2=Robert A.|last3=Gowda|first3=Krishne|last4=Klingele|first4=Audrey J.|last5=Sugar|first5=Darby R.|last6=Stocki|first6=Stacy|last7=Mead|first7=David A.|last8=Schoenfeld|first8=Thomas W.|date=2012-06-04|title=Thermostable DNA Polymerase from a Viral Metagenome Is a Potent RT-PCR Enzyme|journal=PLOS ONE|language=en|volume=7|issue=6|pages=e38371|bibcode=2012PLoSO...738371M|doi=10.1371/journal.pone.0038371|issn=1932-6203|pmc=3366922|pmid=22675552|doi-access=free}}</ref> Во обратната транскрипција на полимеразна верижна реакција, најчесто се користеји два одделни ензими. Првата е ретровирусна обратна транскриптаза за претворање на [[РНК]] во комплементарна ДНК.<ref name=":5" /> Втората е термостабилна ДНК полимераза за засилување на целната секвенца.<ref name=":5" /> 3173 Полимеразата е способна да ги извршува двете ензимски функции што резултира со подобра можност за обратната транскрипција на полимеразна верижна реакција.<ref name=":5" /> Ензимот е откриен со помош на функционално клонирање од [[вирус]] домаќин првично пронајден во топлите извори Октопус (93&nbsp;°C) во [[Јелоустоун|Националниот парк Јелоустоун]].<ref name=":5" />

=== Примени за човековото здравје ===
Еден од тековните предизвици за лекување на [[Бактерии|бактериски]] инфекции е [[Антибиотска отпорност|отпорноста на антибиотици]], која вообичаено се појавува кога пациентите не го земаат целосниот третман со [[лекови]] и оттука им дозволуваат на бактериите да развијат отпорност на антибиотици со текот на времето.<ref name=":4">{{Наведено списание|last=Sommer|first=Morten O. A.|last2=Dantas|first2=Gautam|last3=Church|first3=George M.|date=2009-08-28|title=Functional Characterization of the Antibiotic Resistance Reservoir in the Human Microflora|journal=Science|language=en|volume=325|issue=5944|pages=1128–1131|bibcode=2009Sci...325.1128S|doi=10.1126/science.1176950|issn=0036-8075|pmc=4720503|pmid=19713526}}</ref> За да биде разбрано како да има борба против отпорноста на антибиотици, важно е да биде разбрано како бактерискиот [[геном]] се развива и менува кај здрави поединки без неодамнешна употреба на антибиотици за да биде обезбедена основната линија.<ref name=":4" /> Користејќи функционална техника заснована на клонирање, ДНК изолирана од [[Човек|човечка]] микрофлора била клонирана во вектори на изразување во ''[[Escherichia coli]]''.<ref name=":4" /> Потоа, антибиотиците се применувани како проверка.<ref name=":4" /> Ако [[плазмид]]от содржел [[ген]]ски внес што обезбедува отпорност на антибиотици, [[клетка]]та преживеала и била избрана на плочката.<ref name=":4" /> Ако внесот не давал отпор, клетката умрела и не образувала колонија.<ref name=":4" /> Врз основа на изборот на клеточни колонии кои преживеале, била собрана подобра слика за генетските фактори кои придонесуваат за отпорност на антибиотици. Повеќето од гените за отпор кои биле идентификувани биле претходно непознати.<ref name=":4" /> Со користење на функционална техника заснована на клонирање, може да бидат разјаснети гените кои предизвикуваат отпорност на антибиотици за подобро разбирање на третманот за бактериски инфекции.

== Поврзано ==

* [[Библиотека на комплементарна ДНК]]
* [[Генетска проверка]]
* [[Геномска библиотека]]
* [[Хибридизациска сонда]]
* [[Молекуларно клонирање]]

== Наводи ==
<references />

== Надворешни врски ==

* [http://www.genome.org/cgi/content/full/12/8/1175 Функционално клонирање, подредување и профилирање на изразување на белковините што се врзуваат за нуклеинска киселина] ''Genome Research.com''
* [https://web.archive.org/web/20051104111315/http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/30/9/e40 Нова стратегија за функционално клонирање на ензими со помош на приказ на филаментозен фаг: случај на нуклеотидил трансферази] ''Oxford Journals]''
* [http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/laa/haart/vk/kolehmainen/molecula.pdf Молекуларна генетика на Коеновиот синдром] {{Семарх|url=https://web.archive.org/web/20120205203943/http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/laa/haart/vk/kolehmainen/molecula.pdf |date=2012-02-05 }} ''Одделот за медицинска генетика, Универзитетот во Хелсинки''

[[Категорија:Медицинска генетика]]
[[Категорија:Молекуларна генетика]]
[[Категорија:Генетски техники]]
Предлошки на страницава:
Назад на Функционално клонирање.
Преземено од „https://mk.wikipedia.org/wiki/Функционално_клонирање“