AAVS1

Adeno-asocirano mjesto integracije virusa 1 je mjesto za virusnu integraciju koje je kod ljudi kodira gen AAVS1.^[2] Kotin et al. (1990) izolirali su ćelijske sekvence uz bok integriranih kopija genoma povezanog sa adeno-povezanim virusom (AAV), iz latentno zaražene klonske ljudske ćelijske linije i koristili ih za sondiranje genomskih boja dobijenih iz dodatnih 21 neovisno izvedenih klonova ljudskih ćelija, latentno zaraženih AAV-om.^[3] U genomskim bojama neinficiranih ljudskih ćelijskih linija i primarnog ljudskog tkiva, svaka sonda bočnog niza hibridizirala se u jedinstvene trake. Kotin et al. (1990) zaključili su da se genom AAV preferencijalno integrira u određeno područje ćelijskog genoma. Hibridnim mapiranjem somatskih ćelija utvrdili su da je mjesto integracije jedinstveno za hromosom19. Ljudski parvovirus AAV jedinstven je među eukariotskim virusima sa DNK, po sposobnosti da specifično integrira mjesto. Pomoću hibridizacije in situ, Kotin et al. (1991) mapirali su mjesto integracije na 19q13-qter. Samulski et al. (1991) mapirali su sekvencu AAVS1 na 19q13,4-qter hibridizacijom AAV DNK in situ na hromosome iz latentno zaraženih ćelija. Nalazi sugeriraju da ovaj nepatogeni parvovirus uspostavlja virusnu latenciju, integrirajući svoju DNK specifično u hromosomsku regiju 1. Takva specifična integracija smatrana je jedinstvenom među eukariotskim DNK-virusima. Uključivanje integracije specifične za određenu lokaciju u vektorske šeme AAV treba da učini ovaj vektorski sistem atraktivnim za strategije genske terapije.

Analizom provirusih spojeva, Kotin et al. (1992) odredili su je da se integracija DNK AAV-a dogodila nehomolognim putem rekombinacije. Utvrđeno je da su direktna ponavljanja mnogo veća od slučajnih pojava, neravnomjerno raspoređena duž sekvence AAVS1.^[4][5][6]

Oni konstatiraju da su „R.M.Kotin, R.M.Linden i I.Berns subklonirani u pBluescript (Strategene).“ Ovaj fragment pRI-A je dalje subkloniran za sekvenciranje DNK. Biblioteka cDNK AX biblioteka cDNA (Stratagene) proizvedena od ljudskih fibroblasta W138 RNK hibridizirana je sa dolje opisanim RT-PCR proizvodom. Jedan rekombinantni fag je izoliran kao pozitivan klon. Umetak od 700 bp subkloniran je u pBluescript i određena je sekvenca.

Proizvedeni su ili pristupom sačmarice, koristeći AvaI ili Sau3A ili posebno kloniranjem diskretnih subfragmenata generiranih digestijom s različitim restrikcijskim endonukleazama, npr. PstI ili SnaI. Ugniježđene delecije nastale su ograničenom digestijo, eksonukleazom HI (Pharmacia).

DNK sekvenca je određena metodom završetka didezoksinukleotida, prilagođenom za dvolančanu DNK, jednolančane predloške, a deaza-GTP su korišteni ako je potrebno. Sekvence visoko bogaze parom G + C potvrđene su ponovljenim sekvenciranjem pomoću dsDNK sistema za sekvenciranje ciklusa (BRL) ili sevencing Kit (Bio-Rad).

Kao prajmeri korišteni su komercijalno dostupni Reverse, T3, T7, KS i SK prajmeri (Stratagene) preporučeno. Pored toga, specifični prajmeri AAVS1 dobijeni su od Oligosa itd. i korišteni bez daljnjeg pročišćavanja:

RMLI:

5'-CTTTGGCAGCCTGTGCTGA-3 ';

RML2:

5'-CTGGACGAGGCGCGTCTGATG-3 ';

RML5:

5'-AGCGCAAAGTGACAATGGCCA-3 ';

RK1:

5'-GAGAGGTGACCCGAATCCAC-3 ';

RK2:

5'-CACGTGATGTCCTCTGAGCG-3 ';

RK3:

GTTGCCAGTCTCGATCCGCCCC-3 ';

KL1:

5'-GGGCTGTGGTGAGGAGGGG-3 ';

KL2:

5'-AGCGCTAGCTTCCCTGTCCC-3 ';

KL3:

5'-ACTCTTCGGGGTATCCCAG-3 ';

KL4:

5'-TCCTGCATCCTTCTCCAGGC-3 '.

Računarske analize nukleotidnih i izvedenih aminokiselinskih sekvenci dobijene su pomoću softvera Genetics Computer Group Inc. (verzija 7, Unix, Devereux