Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա

Վերջին տասնամյակում մոլեկուլային կենսաբանության բնագավառում ՊՇՌ-ի մեթոդի հայտնագործումը դարձել է առավել նշանավոր իրադարձություններից մեկը։ 1983 թ Քերրի Մյուլիսը հայտնաբերեց ԴՆԹ-ի որոշակի տեղամասերի in vitro ամպլիֆիկացիայի մեթոդը պոլիմերազային ռեակցիայի կրկնվող ջերմային ցիկլերի ընթացքում։ 1985 թ այս մեթոդը առաջին անգամ օգտագործվեց գործնականում բետա-գլոբինի գենի տեղամասի ամպլիֆիկացիայի համար ԴՆԹ- պոլիմերազի մեծ հատվածի օգնությամբ (Կլենովի հատված)։ ՊՇՌ-ի լայն տարածումը սկսվեց 1988 թ համահեղինակ Սայքի հիմնական աշխատանքի հրատարակության պահից, որտեղ հեղինակները օգտագործել են թերմոֆիլաների ԴՆԹ-պոլիմերազներ և դիտարկել են մեթոդի տեսական հիմքերը, այս հոտդածը 1988-89 թթ դարձավ առավել մեջ բերվող, իսկ 1993 թ Քերրի Մյուլիսին շնորհվեց նոբելյան մրցանակ ՊՇՌ մեթոդի հայտնագործման համար։ ՊՇՌ-ի կազմակերպման համար խառնուրդի մեջ մտնող բաղադրիչների կազմը և պրայմերների (ԴՆԹ-ի կարճ արհեստական սինթեզված մոլեկուլ) օգտագործման հիմնական սկզբունքները ԴՆԹ-ի կրկնօրինակը ստանալու համար առաջին անգամ նկարագրվել 1971 թ-ին Քլեփի կողմից։ Սակայն, այն ժամանակ դեռևս դրսևորված չէր ՊՇՌ-ի հիմնական հատկանիշը՝ ԴՆԹ-ի սկզբնական հատվածի կրկնօրինակման քանակի աստիճանական ավելացումը, որպես արդյունք։ 1983 թ-ին «Cetus» ձեռնարկության աշխատակից Կերի Մյուլիսը առաջարկեց մի մեթոդ, որը հետագայում հայտնի դարձավ որպես պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա՝ ՊՇռ։ Արժե նշել, որ այս հայտնագործմանը համընթաց ուղեկցում էր որոշ տեխնոլոգիաների զարգացումը։ Մասնավորապես այն սարքերի ի հայտ գալը, որոնք թույլ էին տալիս ավտոմատ սինթեզել ԴՆԹ-ի միաշղթա հատվածները (օլիգոնուկլեոտիդները)։ Միևնույն ժամանակ հայտնաբերվեցին գեյզերներում ապրող եզակի միկրոօրգանիզմներ, որոնց ֆերմենտային համակարգը, մասնավորապես ԴնԹ-պոլիմերազը, բարձր ջերմաստիճաններում պահպանում է իր կենսաբանական ակտիվությունը ընդհուպ մինչև 95˚C, որը համարվում է անհրաժեշտ պայման պոլիմերացման շղթայական ռեակցիա անցկացնելու համար։ ՊՇՌ-ի հայտնագործման արդյունքը դարձավ մեթոդի գրեթե անհապաղ գործնական կիրառումը։ Այդ պահից հրատարակությունների քանակը, որոնցում հեղինակները հայտնում էին իրեց աշխատանքներում պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի կիրառման մասին, սկսեց աճել երկրաչափական պրոգրեսիայով։ Այս մեթոդը այնքան հանրամատչելի դարձավ, որ մոլեկուլյար կենսաբանության ոլորտում այսօր արդեն դժվար է պատկերացնել աշխատանք առանց դրա օգտագործման։ ՊՇՌ-ի մեթոդի բուռն զարգացումը ստացվել է հատկապես շնորհիվ «մարդու գենոմ» միջազգային ծրագրի։ Ստեղծվեցին ժամանակակից լազերային տեխնոլոգիաներ, որոնք վերծանում են ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդների հաջորդականությունը։ Եթե ոչ ��աղ անցյալում 250 զույգ նուկլեոտիդների ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդների վերծանման համար պահանջվում էր մեկ շաբաթ, ապա ժամանակակից լազերային սեկվենատորները թույլ են տալիս մեկ օրում որոշել մինչև 5000 զույգ նուկլեոտիդներ։ Սա իր հերթին նպաստում է ԴՆԹ-ի հաջորդականության մասին ինֆորմացիայի տվյալների բազայի նշանակալից աճին։ Ներկայումս մշակվել են պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի բազմազան մոդիֆիկացիաներ (վերափոխումներ), ցույց է տրված թեստ-համակարգի ստեղծման հնարավորությունը միկրօրգանիզմների, բույսերի տարբեր հիվանդությունների և դրանց նկատմամբ կայունության գեների, կետային մուտացիաների հայտնաբերման համար, նկարագրված են մեթոդի տասնյակ տարբեր կիրառություններ։

ՊՇՌ-ն ԴնԹ-ի ամպլիֆիկացիայի մեթոդ է, որի միջոցով մի քանի ժամվա ընթացքում, միլիարդավոր անգամ կարելի է բազմապատկել (անջատել և շատացնել) ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականություն։ Ունեցած ԴՆԹ-ի օրինակի հետազոտումը, զգալիորեն հստակեցնում է հսկայական քանակի կրկնօրինակ ստանալու հնարավորությունը, խիստ որոշակի գենոմի տեղամասից։

ՊՇՌ անցկացնելու համար ռեակցիոն խառնուրդում պետք է առկա լինեն հետևյալ բաղադրիչները՝

Պրայմերներ - արհեստական սինթեզված օլիգոնուկլեոտիդներ, որպես կանոն 15-ից մինչև 30 զույգ նուկլեոտիդներ, նույնությամբ համապատասխանելի տեղամասի ԴՆԹ-ի նշանին։ Նրանք կարևոր դեր են խաղում ամպլիֆիկացիայի իրականացման համար։ Ճիշտ ընտրված պայմանները ապահովում են թեստ-համակարգի յուրահատկությունն ու զգայունությունը։

Taq-պոլիմերազ - ջերմակայուն ֆերմենտ է, որը հնարավոր է դարձնում իրականացնել ԴՆԹ-ի –րդ շղթայի 3՝ ծայրի կառուցումը կոմպլեմենտարության սկզբունքի համաձայն։ Դեզօքսինուկլեոտիդտրիֆոսֆատների խառնուրդ (դնՏՖ) - դեզօքսիադենոզինտրիֆոսֆատ (դԱՏՖ), դեզօքսիգուանոզինտրիֆոսֆատ (դԳՏՖ), դեզօքսիցինտրիֆոսֆատ (դՑՏՖ) և դեզօքսիտիմիդինտրֆոսֆատ (դՏՏՖ) - «շինարարական նյութ»։

Բուֆֆեր – կատիոնների և անիոնների որոշակի խտությամբ խառնուրդ։ Ապահովվում են փոխազդման համար լավագույն պայմանները, ինչպես նաև pH-ի կայուն արժեք։

Ուսումնասիրվող նմուշ – ԴՆԹ-ի մոլեկուլ է, որն ավելացվում է փոխազդող խառնուրդի մեջ, այն կարող է իր մեջ ամփոփել պահանջվող (որոնելի) ԴՆԹ-ի հատվածը։

Եթե ուսումնասիրվող նմուշում առկա է պահանջվող ԴՆԹ-ն, ապա ամպլիֆիկացիայի պրոցեսում դրա հետ կատարվում են մի շարք փոփոխություններ, որոնք ապահովվում են որոշակի ջերմային ցիկլերով։ Ամպլիֆիկացիայի յուրաքանչյուր ցիկլ բաղկացած է 3 էտապից։

Առաջին էտապում անհրաժեշտ է բնափոխել նմուշային ԴՆԹ-ն։ Դրա համար փոխազդող խառնուրդը տաքացնում են մինչև 92-95˚C, որի արդյունքում ԴՆԹ-ի երկշղթայական մոլեկուլները բացվում են դառնալով երկու միաշղթայական մոլեկուլ։

2-րդ էտապում պրայմերները միանում են միաշղթա ԴՆԹ-ի նշանին։ Այս պրոցեսը կրում է «շիկամշակում» անվանումը, որը ծագում է անգլերեն «annealing» մետաղագործական տերմինից, որը նշանակում է որոշակի ռեժիմում ձուլվացքի սառեցումը։ Պրայմերները ընտրում են այնպես, որ նրանք սահմանափակում են պահանջվող հատվածը և կոմպլեմենտարորեն հակադիր են ԴՆԹ-ի շղթաներին։ Շիկամշակում տեղի է ունենում Չարգաֆֆի կոմպլեմենտարության կանոնին համապատասխան, այսինքն՝ ԴՆԹ-ի երկշղթանի մոլեկուլում ադենինի դիմաց միշտ գտնվում է թիմինը, իսկ գուանինի դիմաց` ցիտոզինը։ Եթե այս սկզբունքը չի պահպանվում, ապա պրայմերների շիկամշակում տեղի չի ունենում։ Պրայմերների շիկամշակումից հետո Taq – պոլիմերազը, սկսելով պրայմերի 3` ծայրից, կառուցում է ԴՆԹ-ի 2-րդ շղթան։

3–րդ էտապում փոխազդող խառնուրդում ջերմաստիճանը հասցվում է մինչև Taq – պոլիմերազի աշխատանքի օպտիմումը, հնարավոր է դառնում օգտագործել պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի երկփուլանի ցիկլը, համատեղելով երկու փուլերը՝ շիկամշակումը և էլոնգացիան մեկի մեջ։ Հետագա փուլում շիկամշակումն ու էլոնգացիան բազմիցս կրկնվում են ( ավելի քան 30 անգամ)։ Յուրաքանչյուր ցիկլում ԴՆԹ-ի հատվածի սինթեզված կրկնօրինակի քանակը կրկնապատկվում է։

ԴՆԹ-ի առանձին հատվածի քանակի աստիճանական մեծացում կարելի է արտահայտել հետևյալ բանաձևով՝

A=M*(2n-n-1)~2n

որտեղ` A-ամպլիֆիկացիայի համար պրայմերների քանակն է,

M -ԴՆԹ-ի սկզբնական քանակը, 
n - ամպլիֆիկացիայի ցիկլերի թիվը։

Փաստորեն, որոշ տվյալների հիման վրա, ամպլիֆիկացիայի առանձին ցիկլերի արդյունավետության աստիճանը կազմում է 78-97%։ Այս արժեքը կարող է ավելի քիչ լինել այն դեպում, երբ փոխազդման խառնուրդում առկա լինեն ինհիբիտորներ։ Այդ պատճառով, ամպլիֆիկացիայի արտադրանքի իրական քանակը ավելի լավ կնկարագրի հետևյալ հավասարումը`

A=M*(1+E)n

որտեղ` E - փոխազդման արդյունավետության արժեքն է։ Արժե նկատել, որ ամպլիֆիկացիայի ընթացքում նախնական շղթայի վրա սինթեզվում են նաև երկարավուն հատվածներ, այնուամենայնիվ, դրանց կուտակումը տեղի է ունենում միայն թվաբանական պրոգրեսիայով հետևյալ բանաձևով`

K = M*n

որտեղ՝ K - ամպլիֆիկացիայի երկարավուն արտադրանքի քանակն է,

n – ցիկլերի թիվը։

Այսպիսով, առանձին հատվածները սահմանափակված պայմաններում առաջինն են հայտնվում 2-րդ ցիկլի վերջում, կուտակվում են երկրաչափական պրոգրեսիայով և շատ շուտով սկսում եմ գերակշռել ամպլիֆիկացիայի արտադրնքների թվում։

Նկատի առնենք, որ ամպլիֆիկացիայի պրոդուկտների կուտակման ընթացքը երկրաչափական պրոգրեսիայով ընթանում է միայն սահմանափակ ժամկետում, իսկ հետո դրա արդյունավետությունը բեկումնային ընկնում է։ Սա կապված է այսպես կոչված «բարձրահարթի» էֆեկտով։ Այս տերմինն օգտագործում են ամպլիֆիկացիայի վերջին ցիկլերում ՊՇՌ-ի պրոդուկտների կուտակման ընթացքը նկարագրելու համար, երբ ամպլիկոնների քանակը հասնում է 0, 3-1 մոլի։ Կախված պայմաններից և ամպլիֆիկացիայի փոխազդման ցիկլերի քանակից, «բարձրահարթի» էֆեկտին հասնելու պահին ազդում են սուբստրատների (դնՏՖ-ի և պրայմերների) ուտիլիզացիան (օգտագործումը), ռեակտանտների կայունությունը (դնՏՖ-ի և ֆերմենտի), ինհիբիտորների քանակը ներառյալ պիրոֆոսֆատները և ԴՆԹ-դուպլեքսները, մրցակցությունը ոչ յուրահատուկ արտադրանքների ռեակտատների կամ պրայմեր-դիմերմերի համար, առանձնահատուկ արտադրանքի խտությունը և ոչ ամբողջական բնափոխումը ազդում են ամպլիֆիկացիայի արտադրանքների բարձր խտություն աստիճանի դեպքում։ Որքան փոքր է հետազոտվող ԴՆԹ-ի սկզբնական խտությունը, այնքան բարձր է փոխազդման ելքի ռիսկը դեպի «բարձրահարթի» էֆեկտը։ Այս պահը կարող է վրա հասնել մինչև այն, երբ ամպլիֆիկացիայի առանձնահատուկ արտադրանքի քանակը բավարար կլինի, որպեսզի հնարավոր դառնա վերլուծման ենթարկել դրանց։ Միայն լավագույն թեստ-համակարգերն են թույլ տալիս խուսափել դրանից։

Կենսաբանական նյութի փորձարկման նախապատրաստությունը Կախված առաջադրված խնդրից ԴՆԹ-ի անջատման համար օգտագործում են տարբեր մեթոդիկաներ։ Դրանց էությունն է նմուշից ԴՆԹ-ի լուծազատումը (ստացումը) և հեռացումը կամ չեզոքացումը կողմնակի խառնուրդներից ԴՆԹ-ի մաքուր պատրաստուկ ստանալու համար, որը պիտանի է ՊՇՌ կազմակերպելու համար։ Երբեմն բավական է լինում 5-10 րոպե լավ եռացնել, սակայն, մեծ մասամբ պահանջվում է ավելի բարդ մեթոդներ։ ԴՆԹ-ի մաքուր պատրաստուկի ստացման ստանդարտ և արդեն դասական դարձած մեթոդը նկարագրվում է Դոյլի կողմից։ Այն իրենից ներկայացնում է ԴՆԹ-ի անջատման CTAB մեթոդը։ Դոյլի մեթոդը փոքր մոդիֆիկացիաներով կիրառվել է մեր կողմից։

Ամպլիֆիկացիա և պրոդուկտների հայտնաբերում Ամլիֆիկացիա իրականացնելու համար անհրաժեշտ է նախապատրաստել փոխազդող խառնուրդ և նրա մեջ ներառել ԴՆԹ-ի վերլուծվող նմուշը։ Ընդ որում, կարևոր է հաշվի առնել պայմանների շիկամշակման որոշ առանձնահատկություններ։ Բանն այն է, որ որպես կանոն, վերլուծվող կենսաբանական նմուշում մասնակցում են (առկա) են ԴՆԹ-ի տարբեր մոլեկուլներ, որոնց նկատմամբ ռեակցիայում օգտագործվող պայմանները ունեն մասնակի, իսկ որոշ դեպքերում զգալի համաբանություն (հոմոլոգիա)։ Բացի դրանից, պրայմերները կարող են միմյանց հետ թրծվել առաջացնելով պրայմերներ-դիմերներ։ Թե մեկը, թե մյուսը հանգեցնում են պրայմերների զգալի սպառման ռեակցիայի նյութերի երկրորդական (ոչ հատուկ) սինթեզի վրա, և որպես հետևանք, զգալիորեն պակասեցնում են համակարգի զգայունությունը։ Դա դժվարեցնում կամ անհնարին է դարձնում էլեկտրոֆորեզով իրականացված ռեակցիայի արդյունքների ընթերցումը։ Միջոցները, որոնք թույլ են տալիս զգալի չափով իրականացնել պրայմերների ոչ հատուկ շիկամշակումը։

• Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols. 226. pp. 3–6. doi:10.1385/1-59259-384-4:3. ISBN 1-59259-384-4. edit
• Bing, D. H., C. Boles, F. N. Rehman, M. Audeh, M. Belmarsh, B. Kelley, and C. P. Adams. (1996). "Bridge amplification: a solid phase PCR system for the amplification and detection of allelic differences in single copy genes". Genetic Identity Conference Proceedings, Seventh International Symposium on Human Identification.
• Cheghamirza K., Koveza O., Konovalov F. and Gostimsky S. ( 2002). “Identification of RAPD markers and their use for molecular mapping in pea (Pisum sativum L.)”. Cell. Mol. Biol. Lett. 7(2B)։ 649-655. pp.
• "Chemical Synthesis, Sequencing, and Amplification of DNA (class notes on MBB/BIO 343)". Arizona State University. Retrieved 2007-10-29.
• Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin и W.M. Gelbart. (1996). An introduction to genetic analysis (6th edn.).
• Kleppe, K. et al. (1971). "Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases". J. Mol. Biol. 56 (2): 341–361.
• Stpeien L. J. et al. Appl. (2001).Genet. 40: 317-334. pp.
• Venter J, et al. (2001). «The sequence of the human genome». Science 291 (5507)։ 1304-51. PMID 11181995

• Principle of the PCR