Isoencima

En bioquímica, os isoencimas^[1] ou isocimas^[2] (tamén isoenzimas^[3] e isozimas) son encimas que difiren na súa secuencia de aminoácidos pero catalizan a mesma reacción química. Estes encimas xeralmente teñen distintos valores dos seus parámetros cinéticos, como a constante de Michaelis-Menten (K_M) ou a V_max, diferentes propiedades regulatorias ou distintas mobilidades electroforéticas ou propiedades inmunolóxicas^[4]. A existencia de isoencimas permite unha regulación moi precisa do metabolismo para adaptarse ás necesidades particulares dun determinado tecido ou estado de desenvolvemento (por exemplo no caso da lactato deshidroxenase (LDH)). Os isoencimas son isoformas (variantes moi relacionadas) de encimas. En moitos casos, están codificadas por xenes homólogos que diverxiron co tempo.

Un exemplo de isoencimas son as hexoquinases, das que hai 4 isoformas. As hexoquinases I, II e III (ou A, B, C e D) teñen unha grande afinidade pola glicosa e poden fosforilar á glicosa e outras hexosas, son inhibidas pola glicosa 6-fosfato, e están amplamente distribuídas nos tecidos. A hexoquinase IV denomínase glicoquinase aparece no fígado, páncreas e algúns outros tecidos, ten unha baixa afinidade pola glicosa, que é a única hexosa que pode fosforilar, e non é inhibida pola glicosa 6-fosfato. As diferentes características regulatorias e baixa afinidade pola glicosa da glicoquinase (comparada con outras hexoquinases), permítelle realizar diferentes funcións en células de órganos específicos relacionadas coa dispoñibilidade de glicosa, como o control da liberación de insulina polas células beta do páncreas, ou favorecer a síntese do glicóxeno pola glicóxeno sintase nas células do fígado, procesos que só deben ocorrer cando a glicosa é abundante, ou cando hai algún problema para o organismo. As catro están codificadas en distintos xenes de distintos cromosomas.

Outro exemplo é a lactato deshidroxenase, que está formada por dúas subunidades distintas, que se combinan formando un tetrámero en diferentes combinacións dependendo do tecido, tal como se mostra na táboa. As subunidades chámanse H (heart, corazón) e M (músculo), xa que son as que abundan nos tecidos deses órganos. A distribución destes isoencimas cambia dun tecido a outro, ou segundo o lugar da célula (citosol, mitocondria) ou segundo o estado de desenvolvemento (feto, adulto). Isto reflicte as diferenzas metabólicas entre os tecidos; así, a forma M₄ favorece no músculo a redución rápida de piruvato a lactato, pero a forma H₄ favorece no corazón a oxidación rápida de lactato a piruvato. Nalgunhas enfermidades obsérvase un aumento dalgunha das formas; así por exemplo, despois dun infarto cardíaco aumenta a concentración plasmática de H₄ debido á rotura de células, ou aumentan no plasma durante a hepatite as formas M₄ e HM₃.^[2] A lactato deshidroxenase (LDH) cataliza a seguinte reacción reversible:

Outros exemplos son os isoencimas da creatina quinase (dímero con subunidades M e B nas combinacións MM, MB e BB ^[5]), os isocimas do citocromo P450 ^[6], que xogan un importante papel no metabolismo e na esteroidoxénese, e os da fosfatase alcalina ^[7][8] e a amilase, entre outros. A determinación dos niveis plasmáticos de moitos isoencimas é importante para o diagnóstico e estudo de diversas enfermidades.

Os isoencimas foron descritos por primeira vez por R. L. Hunter e Clement Markert (1957), que os definiron como diferentes variantes dun mesmo encima que teñen idénticas funcións e están presentes no mesmo individuo. Esta definición abrangue dous aspectos: (1) variantes de encimas que son o produto de diferentes xenes e que representan diferentes loci xeneticos (que son os "isoencimas"), pero tamén (2) encimas que son o produto de diferentes alelos dun mesmo xene (que son os denominados "aloencimas" ou "alocimas").

Os isocimas xeralmente son o resultado dunha duplicación xénica, pero poden tamén orixinarse por poliploidización ou por hibridación de ácidos nucleicos. Co tempo, durante a evolución, se a función da nova variante permanece idéntica á orixinal, entón é probable que unha ou outra das variantes se perda a medida que se acumulen as mutacións, orixinando un pseudoxene. Porén, se as mutacións non impiden inmediatamente que o encima siga funcionando, senón que modifican a súa función ou o seu patrón de expresión xénica, entón as dúas variantes poden estar favorecidas pola selección natural e vanse especializar en diferentes funcións. Por exemplo, poden expresarse en diferentes estados de desenvolvemento ou en diferentes tecidos.

Pola súa parte, os aloencimas poden orixinarse por causa dunha mutación puntual ou por eventos de inserción-deleción (ver indel) que afectan á secuencia codificadora do ADN dun mesmo xene, orixinando un novo alelo. Como con calquera outra mutación nova, poden ocorrerlle tres cousas ao novo aloencima:

1. O máis probable é que o novo alelo non sexa funcional e orixine unha perda de eficacia biolóxica (fitness) e sexa eliminado da poboación pola selección natural.
2. Alternativamente, se o residuo de aminoácido que se cambiou está nunha parte pouco importante do encima (por exemplo, lonxe do sitio activo), entón a mutación pode ser selectivamente neutra e estar suxeita á deriva xenética.
3. En raros casos, a mutación pode orixinar un encima que é máis eficiente, ou que pode catalizar unha reacción algo diferente, orixinando un aumento da fitness e ser favorecida pola selección natural.

Nalgúns casos os termos isoencima e aloencima poden aparecer usados practicamente como sinónimos, pero en realidade son diferentes. Os aloencimas son encimas de diferentes alelos do mesmo xene, e os isocimas son encimas de diferentes xenes que catalizan a mesma reacción.^[9]

Os isoencimas (e os aloencimas) son variantes do mesmo encima. A menos que sexan idénticos nas súas propiedades bioquímicas, por exemplo nos seus substratos e cinética encimática, poden distinguirse por probas bioquímicas. De todos modos, tales diferenzas son ás veces moi sutís (especialmente entre aloencimas que xeralmente teñen un efecto "neutro" na fitness). Por outra parte, dous encimas que difiren significativamente na súa función é probable que nin sequera non foran identificados como isoencimas.

Aínda que os isoencimas son idénticos nas súas funcións, poden difereir noutros aspectos. En particular, as substitucións de aminoácidos que cambian a carga eléctrica do encima poden servir para identificalos por electroforese en xel ^[9], e isto forma a base para o uso de isoencimas como marcadores moleculares. Para identificar isoencimas, un extracto cru de proteína que se obtén triturando un tecido animal ou vexetal cun tampón de extracción, sométese a unha separación dos seus compoñentes segundo a súa carga por electroforese en xel de amidón de pataca ou, máis modernamente, de poliacrilamida ^[10].

Todas as proteínas do tecido están presentes no xel, polo que para identificar encimas concretos debe utilizarse unha proba que ligue a súa función cunha reacción de coloración. Por exemplo, a detección pode basearse na precipitación localizada dun indicador soluble de tinguidura como sales de tetrazolio, que se volven insolubles cando son reducidos por un cofactor como a NAD⁺ ou NADP⁺, o que se produce nas zonas con actividade do encima. Este método de ensaio require que os encimas sexan aínda funcionais despois da súa separación (electroforese en xel nativa), e é a maior dificultade á hora de utilizar os isoencimas como unha técnica de laboratorio.

Os isoencimas e os aloencimas son utilizados como marcadores moleculares. En xenética de poboacións é fundamental o estudo das causas e efectos da variación xenética dentro dunha poboación e entre poboacións, e antes, os isoencimas eran un dos marcadores moleculares máis usados para este propósito. Aínda que este uso xa foi superado polo uso das variacións do ADN, que dan máis información, como a secuenciación directa do ADN, polimorfismos dun só nucleótido e microsatélites, estes encimas aínda se usan como un rápido e barato sistema marcador en certos casos, como en proxectos de investigación que só necesitan identificar baixos niveis de variación xenética, como a cuantificación de sistemas de apareamento.

• Hunter, R. L. e C.L. Merkert. (1957) Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels. Science 125: 1294-1295
• Uzunov, P. e Weiss, B.(1972) "Separation of multiple molecular forms of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate phosphodiesterase in rat cerebellum by polyacrylamide gel electrophoresis." Biochim. Biophys. Acta 284:220-226.
• Uzunov, P., Shein, H.M. e Weiss, B.(1974) "Multiple forms of cyclic 3',5'-AMP phosphodiesterase of rat cerebrum and cloned astrocytoma and neuroblastoma cells." Neuropharmacology 13:377-391.
• Weiss, B., Fertel, R., Figlin, R. e Uzunov, P. (1974) "Selective alteration of the activity of the multiple forms of adenosine 3',5'-monophosphate phosphodiesterase of rat cerebrum." Mol. Pharmacol.10:615-625.
• Weiss, B. e Hait, W.N.(1977) "Selective cyclic nucleotide phosphodiesterase inhibitors as potential therapeutic agents." Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 17:441-477.
• Wendel, JF, e NF Weeden. 1990. "Visualisation and interpretation of plant isozymes." pp. 5–45 en D. E. Soltis e P. S. Soltis, eds. Isozymes in plant biology. Chapman and Hall, Londres.
• Weeden, NF, e JF Wendel. 1990. "Genetics of plant isozymes". pp. 46–72 in D. E. Soltis e P. S. Soltis, eds. Isozymes in plant biology. Chapman and Hall, Londres
• Crawford, DJ. 1989. "Enzyme electrophoresis and plant systematics". pp. 146–164 en D. E. Soltis e P. S. Soltis, eds. Isozymes in plant biology. Dioscorides, Portland, Oregon.
• Hamrick, JL, and MJW Godt. 1990. "Allozyme diversity in plant species". pp. 43–63 in A. H. D. Brown, M. T. Clegg, A. L. Kahler e B. S. Weir, eds. Plant Population Genetics, Breeding, and Genetic Resources. Sinauer, Sunderland

• Development of new isozyme specific therapeuticsArquivado 03 de marzo de 2016 en Wayback Machine. - Ácido graxo dioxixenases e hormonas eicosanoides (en inglés)