Cromosoma artificial bacteriano
BAC, o cromosoma artificial bacteriano, es un Vector de clonación usado para clonar fragmentos de ADN (de 100 a 300 kb de tamaño; media de 150 kb) en Escherichia coli, basado en el plásmido factor-F encontrado de modo natural en la bacteria E. coli.[1][2][3]
Es uno de los tipos de vectores de clonación conocidos como "vectores de alta capacidad", que incluye cósmidos,[4] BACs, PACs y YACs[5], por contraposición con plásmidos, vectores derivadores de fago lambda, fagémidos y fásmidos, que son de baja capacidad.
Los BACs son muy utilizados como vectores de clonación para la construcción de genotecas genómicas, como en el Proyecto Genoma Humano. Su gran utilización se debe a su notable capacidad, su gran estabilidad y su bajo porcentaje de quimerismo.
Dado el gran tamaño de los BAC recombinantes las estrategias de introducción más eficientes han sido mediante electroporación.
Un BAC típico consta de:
- OriS: origen de replicación del factor F
- repE: control de la replicación del plásmido
- parA, B, C: control de la replicación
- CMr: cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) (gen de resistencia a cloranfenicol)
- LacZ’: con un polilinker en su interior. Se usa para el ensayo de alfa-complementación.
- a) Se corta el vector con HindIII para linealizarlo.
- b) Se desfosforilan los extremos 5’ del vector para evitar autoligación.
- c) Se digiere nuestra muestra con HindIII o compatible. Se seleccionan los fragmentos según su tamaño por electroforesis y se purifican.
- d) Llevamos a cabo la reacción de ligación.
- e) Transferencia de los vectores a una célula por electroporación.
- f) Selección de los clones en un medio con cloranfenicol y X-gal (son positivos los que sobreviven en cloranfenicol y carecen de actividad beta-galactosidasa.
Referencias
editar- ↑ O'Connor, Michael; Peifer, Mark; Bender, Welcome (16 de junio de 1989). «Construction of Large DNA Segments in Escherichia coli». Science (en inglés) 244 (4910): 1307-1312. ISSN 0036-8075. doi:10.1126/science.2660262. Consultado el 24 de septiembre de 2022.
- ↑ Shizuya, H; Birren, B; Kim, U J; Mancino, V; Slepak, T; Tachiiri, Y; Simon, M (15 de septiembre de 1992). «Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.». Proceedings of the National Academy of Sciences (en inglés) 89 (18): 8794-8797. ISSN 0027-8424. PMC 50007. PMID 1528894. doi:10.1073/pnas.89.18.8794. Consultado el 24 de septiembre de 2022.
- ↑ Shizuya, Hiroaki; Kouros-Mehr, Hosein (2001). «The development and applications of the bacterial artificial chromosome cloning system». The Keio Journal of Medicine 50 (1): 26-30. PMID 11296661. doi:10.2302/kjm.50.26. Consultado el 24 de septiembre de 2022.
- ↑ Hohn, B.; Murray, K. (1977-08). «Packaging recombinant DNA molecules into bacteriophage particles in vitro». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74 (8): 3259-3263. ISSN 0027-8424. PMID 333431. doi:10.1073/pnas.74.8.3259. Consultado el 24 de septiembre de 2022.
- ↑ Hsiao, C. L.; Carbon, J. (1979-08). «High-frequency transformation of yeast by plasmids containing the cloned yeast ARG4 gene». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76 (8): 3829-3833. ISSN 0027-8424. PMID 386351. doi:10.1073/pnas.76.8.3829. Consultado el 24 de septiembre de 2022.